Chương 3. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.4. Phân tích đa dạng di truyền bằng kỹ thuật AFLP
Thí nghiệm phân tích đa dạng di truyền được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Pawlik và cộng sự (2012), có điều chỉnh một số công đoạn để phù hợp với thực tế nghiên cứu. Toàn bộ thí nghiệm được lặp lại 03 lần để đảm bảo sự chính xác của kết quả phân tích. Quy trình thực hiện bao gồm các bước:
3.2.4.1. Tinh sạch DNA sau tách chiết:
Bổ sung 1àl RNase (10mg/ml) vào 100àL dung dịch chứa DNA, ủ 30 phỳt ở nhiệt độ phòng để loại bỏ RNA.
Điện di sản phẩm trên gel agarose 1%, dung môi TE 0,5X (pH 8,0) kiểm tra sự nguyên vẹn của DNA.
Các mẫu DNA nguyên vẹn được chọn để thực hiện các công đoạn sau nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả phân tích
3.2.4.2. Cắt DNA:
Thành phần của phản ứng cắt được thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng cắt
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tớch (àL)
1 Dung dịch DNA 1àg -
2 PstI Fastdigest - 1
3 Buffer Fastdigest 10X 1X 1
4 Nước cất 2 lần - -
Tổng thể tích 1 phản ứng 20
Ủ ở bể ổn nhiệt 37oC trong 1 – 2 giờ.
18
Kiểm tra kết quả bằng điện di trên gel agarose 1%, dung môi TE 0,5X (pH 8.0)
Các mẫu đạt thì sau điện di sẽ tạo smear.
3.2.4.3. Tinh sạch DNA sau khi cắt:
Bổ sung sodium acetate 3M vào eppendorf chứa DNA đã phân cắt với lượng 1/10 thể tích dung dịch DNA.
Bổ sung EtOH tuyệt đối với lượng gấp 2 – 2,5 lần thể tích dung dịch DNA.
Ủ -80oC khoảng 1 giờ.
Ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4oC trong 20 phút.
Loại bỏ phần dịch, thu lấy tủa.
Rửa tủa bằng EtOH 70%.
Ly tâm 15.000 vòng/phút ở 4oC trong 7 phút, loại bỏ phần dịch.
Lặp lại bước rửa tủa bằng EtOH 70% như trên.
Làm khô tủa ở 50oC trong 20 – 30 phút.
Bổ sung 11,5àL nước cất vào eppendorf và để ở nhiệt độ phũng khoảng 30 phỳt để hòa tan tủa.
Bảo quản mẫu ở -20oC cho đến khi sử dụng.
3.2.4.4. Tạo đầu tiếp hợp PstI
Thành phần phản ứng tạo đầu tiếp hợp được thể hiện ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Thành phần phản ứng tạo đầu tiếp hợp PstI STT Thành phần Thể tớch (àL)
1 PstIAF* 10àM 5
2 PstIAR* 10àM 5
(*) Trình tự các đầu tiếp hợp PstI thể hiện ở Phụ lục.
Ủ trên máy luân nhiệt (Bio-rad, Hoa Kỳ) với chương trình: 95oC trong 10 phút, 37oC trong 30 phút.
Bảo quản mẫu ở -20oC cho đến khi sử dụng.
3.2.4.5. Nối DNA
Phối trộn các thành phần cho một phản ứng nối theo Bảng 3.5.
19 Bảng 3.5. Thành phần phản ứng nối DNA
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích
(àL)
1 Đầu tiếp hợp PstI 10 àM 4 àM 10
2 DNA đó cắt và tinh sạch Tương đương 34ng/àL 11,5
3 T4 ligase 5U 0,2 U 1
4 T4 ligase buffer 10X 1 X 2,5
Tổng thể tích 1 phản ứng 25
Ủ 16oC trên máy luân nhiệt Blue-Ray (Biotech), qua đêm.
3.2.4.6. Tinh sạch sản phẩm nối
Các bước thực hiện tương tự như quy trình tinh sạch DNA sau khi cắt.
Làm khô tủa ở 50oC trong 20 – 30 phút.
Hũa tan tủa bằng 50àL nước cất 2 lần.
Bảo quản mẫu ở -20oC cho đến khi sử dụng.
3.2.4.7. PCR không chuyên biệt
Thành phần của phản ứng PCR không chuyên biệt sản phẩm DNA đã nối được phối trộn theo Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Thành phần phản ứng PCR không chuyên biệt
STT Thành phần Nồng độ cuối Thể tích
(àL) 1 Oligonucleotide PstIAF* 10 àM 0,5 àM 1,25
2 DNA đã cắt nối và tinh sạch - 5
3 Qiagen Tag Mix 0,05 U/àL 12,5
4 Nước cất 2 lần 6,25
Tổng thể tích 1 phản ứng 25
(*):Trình tự Oligonucleotide PstIAF thể hiện ở Phụ lục.
Quá trình khuếch đại không chuyên biệt cho sản phẩm PCR đã nối được thực hiện trên máy luân nhiệt Blue-Ray (Biotech) với các thông số thể hiện ở Hình 3.2.
20 Điện di sản phẩm PCR không chuyên biệt trên gel agarose 1%, dung môi TE 0,5X (pH 8.0). Phản ứng PCR thành công khi xuất hiện dạng smear trên gel.
Hình 3.2: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR không chuyên biệt 3.2.4.8. PCR chuyên biệt
Thành phần của phản ứng PCR chuyên biệt sản phẩm DNA đã nối được phối trộn theo Bảng 3.7.
Bảng 3.7. Thành phần phản ứng PCR chuyên biệt
STT Thành phần Nồng độ
cuối
Thể tích (àL) 1 Mồi PstI G/GC/AAG/CAA* 10 àM 0,2 àM 1 2 Sản phẩm PCR không chuyên biệt 1X 1
3 Qiagen Tag Mix 0,05U/àl 6
4 Nước cất 2 lần - 18
Tổng thể tích 1 phản ứng 25
(*): Trình tự các mồi thể hiện ở Phụ lục.
Quá trình khuếch đại chuyên biệt cho sản phẩm DNA đã nối được thực hiện trên máy luân nhiệt (Bio-rad, Hoa Kỳ) với các thông số được thể hiện ở Hình 3.3.
Hình 3.3: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR chuyên biệt
Điện di sản phẩm PCR chuyên biệt trên gel agarose 1,6%, dung môi TE 0,5X (pH 8.0). Phản ứng PCR thành công khi xuất hiện các băng phân tách rõ ràng.
3.2.4.9. Phân tích kết quả điện di:
21 Các băng được mã hóa theo nhị phân, so hàng ngang mẫu nào có vạch thì đánh số 1 và mẫu nào không có vạch thì đánh số 0, lưu lại dưới dạng file excel. Dựa trên bảng nhị phân này, phần mềm NTSYSpc2.1 được sử dụng để ước lượng khoảng cách di truyền của các giống nấm bằng thuật toán UPMA.