3.2.1. Quy trình tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4 trong hệ kín
Quy trình tạo hạt nanô ôxít sắt trong hệ kín khí Argon [2] được tóm tắt bằng sơ đồ hình 3.1 sau:
Siêu âm
Hình 3.1 . Quy trình tổng hợp hạt nanô ôxít sắt Fe3O4.
Để có được mẫu tốt nhất, tôi đã khảo sát việc tổng hợp nhiều mẫu hạt từ Fe3O4 và các mẫu đều được sấy chân không ở các nhiệt độ 50°C, 70°C sau đó khảo sát các tính chất của hạt để chọn mẫu tốt nhất thực hiện bước tiếp theo.
Thu hạt bằng nam châm Rửa với nước cất và EtOH Sấy khô trong chân không ở
50oC/ 15h
FeCl3..6H2O Nước cất FeCl2.4H2O Nước cất
Dd FeCl2
Dd FeCl3
Hỗn hợp
Fe2+, Fe 3+ NaOH 25%
Dung dịch có chứa hạt kết tủa
3.2.2. Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4
Để khảo sát phân tán hạt nanô ôxít sắt từ , chúng tôi khảo sát xử lý bề mặt hạt bằng HNO3, axit oleic và trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA.
Tiến hành chụp TEM để chọn ra phương pháp tối ưu cho quá trình chức năng hóa bề mặt.
a) Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng HNO3
Lấy 100 mg hạt nanô ôxít sắt từ phân tán trong 100 ml dung dịch HNO3 đánh siêu âm 4 giờ ở nhiệt độ phòng.
Hạt phân tán được rửa ly tâm với nước cất năm lần để loại bỏ tạp chất còn dư.
Để khảo sát việc phân tán của hạt nanô ôxít sắt chụp ảnh TEM.
Hình 3.2. Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng HNO3. b) Quy trình xử lý bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA
Lấy 500 mg hạt nanô ôxít sắt từ phân tán siêu âm trong 20 ml nước cất, 10 ml axit oleic siêu âm 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Hạt phân tán được rửa với cyclo hecxan năm lần để loại bỏ tạp chất còn dư.
Để khảo sát việc phân tán của hạt nanô ôxít sắt chụp ảnh TEM.
Hình 3.3. Quy trình xử lý hạt Fe3O4 bằng OA.
c) Quy trình tổng hợp và xử lý trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA Cho hỗn hợp muối sắt gồm 3,1736 g FeCl
2.4H
2O (0,016 mol) và 8,656 g FeCl3.6H
2O (0,032 mol) vào bình cầu ba cổ có chứa 320 ml nước khử ion. Đánh siêu âm hỗn hợp trong 30 phút, đồng thời nâng nhiệt độ lên 50°C và sục khí Argon. Khuấy trong 1 giờ sau đó cho tiếp 40 ml dung dịch NaOH vào. Khi đó, hỗn hợp dung dịch sẽ chuyển màu dần dần từ cam sang nâu và cuối cùng là đen. Tiếp tục khuấy và duy trì nhiệt độ trong 30 phút nữa để phản ứng xảy ra hoàn toàn và cho 3 ml axit oleic vào phản ứng và đánh siêu âm trong vòng 1 giờ. Khí Argon được sục liên tục vào dung dịch trong suốt quá trình phản ứng.
Hạt nanô Fe3O4 thu được bằng cách lọc rửa nhiều lần với nước khử ion và lắng bằng nam châm vĩnh cửu. Cuối cùng, sản phẩm lắng đọng được đem sấy chân không ở 50°C trong 15 giờ.
Hình 3.4. Quy trình tổng hợp và xử lý trực tiếp bề mặt hạt Fe3O4 bằng OA.
3.2.3. Quy trình bao bọc hạt nanô Fe3O4 bằng SiO2
Hình 3.5. Quy trình bao bọc hạt Fe3O4 bằng SiO2.
Hình 3.6. Mô hình của hạt Fe3O4 xử lý OA được phủ lớp SiO2 (lớp màu cam).
Kích thước hạt nanô ôxít sắt được bao bọc SiO2 hay bề dày của lớp vỏ SiO2 có thể điều khiển bằng cách thay đổi tỉ lệ khối lượng hạt sắt trên thể tích nước, tỉ lệ thể tích giữa nước với thể tích TEOS và NH3 [2]. Tuy nhiên trong giới hạn về thời gian luận văn này chúng tôi chưa khảo sát điều đó.
3.2.4. Quy trình xử lý bề mặt Fe3O4@SiO2 bằng piranha
Cho 100 mg hạt Fe3O4 được xử lý bằng dung dịch piranha (hỗn hợp của H2SO4 và H2O2 theo tỉ lệ 7:3) đánh siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Hạt nanô Fe3O4 thu được bằng cách lọc rửa ly tâm 5 lần với nước khử ion. Cuối cùng, sản phẩm lắng đọng được đem sấy chân không ở 80°C trong 9 giờ.
Hình 3.7. Quy trình xử lý bề mặt Fe3O4@SiO2 bằng piranha.
3.2.5. Quy trình gắn kết GPS lên bề mặt Fe3O4@SiO2 đã xử lý
γ-glycidoxypropyltrimethoxy silane (GPS) mà một hợp chất thuộc họ silane.
Có cấu trúc chung là: X-R-Si(OR’)3
Trong đó X:các nhóm chức hữu cơ (Amino, Vinyl, Alkyl…) R‟: các nhóm methyl, ethyl, isopropyl…
R: Aryl hoặc Alkyl (CH2)n với n = 0, 1 hoặc 3.
Ở đề tài này, chúng tôi lựa chọn GPS với mục đích cố gắng làm giảm lực đẩy giữa các liên kết trên bề mặt hạt từ phủ SiO2 và làm cho bề mặt trở nên đồng đều hơn.
Cơ chế gắn của GPS cũng tương tự như phủ SiO2 lên hạt nanô Fe3O4 nhưng trước đó bề mặt của hạt từ phủ SiO2 đã được xử lý bằng dung dịch piranha (hỗn hợp của H2SO4 và H2O2 theo tỉ lệ 7:3).
Sau khi đã xử lý với piranha, hạt nanô Fe3O4 đã phủ SiO2 sẽ được đặt trong dung dịch có chứa 1% GPS và 0,2% TEA (triethylamine) trong toluene và siêu âm gia nhiệt tới 70oC trong vòng 8 giờ. Sau đó tiếp tục siêu âm ở nhiệt độ phòng 12 giờ và tiếp tục ở 70oC thêm 8 giờ nữa.
GPS gắn lên Fe3O4@SiO2 theo phương trình :
Hình 3.8. Cơ chế gắn GPS lên Fe3O4@SiO2.
Hình 3.9. Quy trình gắn kết GPS trên bề mặt Fe3O4@SiO2 đã xử lý.
3.2.6. Giải vòng epoxy trên GPS
GPS trong môi trường nước có chứa NaCl và HCl sẽ xảy ra phản ứng mở vòng epoxy để tạo thành diol. Trong trường hợp này, HCl đóng vai trò là một xúc tác làm cho H+ sẽ proton hóa vào nguyên tử O của vòng epoxy, C kề O sẽ càng thiếu điện tử, tạo điều kiện cho tâm thân hạch tấn công dễ dàng hơn. Từ đó bề mặt hạt nanô sẽ là:
Hình 3.10. Mô hình của mẫu M3_SG đã giải vòng epoxy.
Sự thủy phân này được thực hiện bằng cách ngâm hạt đã gắn GPS trong 100 ml dung dịch NaCl 0.1 M có bổ sung vài giọt HCl cho tới pH = 4. Hỗn hợp trên được siêu âm trong vòng 30 phút ở 70°C.
Hình 3.11. Quy trình thủy phân vòng epoxy cho hạt Fe3O4@SiO2/GPS.
3.2.7. Cố định CDI lên hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O
Hạt từ sau khi gắn thành công GPS và đã giải vòng epoxy tiếp tục được ngâm trong dung dịch gồm 1-50 mg CDI trong 1ml acetonitrile (Đối với khoảng 1 mg hạt).
Sau đó sẽ được siêu âm ở nhiệt đô phòng trong vòng một giờ.
Hình 3.12. Quy trình cố định CDI lên hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O.
Cơ chế gắn của CDI:
Hình 3.13. Cơ chế gắn của CDI.
3.2.8. Quy trình gắn kết protein BSA lên mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O và mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI
Tham khảo một số bài báo nghiên cứu cho thấy rằng họ đã thành công trong việc sử dụng hạt nanô sắt từ để gắn kết với các protein khác nhau như albumin hoặc với các tế bào CD4, CD8T... Kết quả cho thấy khả năng, mức độ gắn kết của hạt nanô ôxít sắt từ với protein là khá tốt, từ đó dễ dàng thực hiện các bước phân tách sau này [11,16]. Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát khả năng gắn kết của hạt nanô Fe3O4@SiO2/GPS-O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI với protein BSA từ đó làm rõ hơn vai trò của CDI trong chức năng hóa bề mặt hạt nanô ôxít sắt.
Đầu tiên chúng tôi loại bỏ dung môi actone ra khỏi mẫu hạt Fe3O4@SiO2/GPS- O và Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI. Sau đó chúng tôi lần lượt hòa tan mỗi mẫu hạt nanô ôxít sắt này vào dung dịch đệm BSA để tạo thành dung dịch A1 và A2 đều có nồng độ 10 mg/ml. Bên cạnh đó, chúng tôi chuẩn bị hỗn hợp gồm protein BSA và dung dịch đệm PBS để tạo thành dung dịch B với nồng độ 300àg/ml như đó nờu trong bảng 3.2 và tiến hành phản ứng theo như quy trình hình 3.14.
Bảng 3.2. Thành phần các dung dịch để tiến hành phản ứng với protein BSA.
Mẫu Phân
loại Thành phần Nồng độ
Dung dịch
A
A1 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O + 1ml PBS 10mg hạt/ml A2 10mg hạt Fe3O4@SiO2/GPS-O/CDI + 1ml PBS 10mg hạt/ml
Dung dịch B 300àg BSA + 1ml PBS 300àg/ml
Hình 3.14. Quy trình gắn kết protein BSA.
Hình 3.15. Cơ chế gắn protein BSA.