CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp đánh giá độ đa dạng
3.4.1. Phương pháp khảo sát hình thái (phương pháp Aspekhov (1965))
Dựa vào đặc điểm hình thái các cơ quan, đặc biệt là hình thái cơ quan sinh sản, vì loại cơ quan này ít biến đổi hơn so với cơ quan sinh dưỡng khi điều kiện môi trường thay đổi. Những thực vật càng gần nhau càng có những đặc điểm chung về hình thái. Tiến hành bằng cách đo chiều cao cây, đường kính thân, độ dài lá. Khảo sát độ ăn sâu của rễ bằng cách khoan đất và đo độ ăn sâu của rễ trên phẫu diện đất vừa khoan,… Mô tả chi tiết hình thái và tính các hệ số có liên quan.
3.4.2. Phương pháp khảo sát cấu tạo giải phẫu
Qui trình được tiến hành tại phòng thí nghiệm Thực vật – bộ môn Sư phạm Sinh học – trường Đại học Cần Thơ.
+ Thu mẫu cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản của các cây đại diện (có đầy đủ lá non, lá bánh tẻ, lá già, hoa, hạt). Bảo quản mẫu trong ngăn mát tủ lạnh hoặc ngâm trong dung dịch FAA. Chọn các cây lấy mẫu mang tính đại diện, mỗi cây cắt 3 mẫu, sau đó trộn đều lại và lấy ngẫu nhiên mẫu để giải phẫu. Thu mẫu lá, hoa, quả ở các giai đoạn non, trưởng thành, già (dựa vào màu sắc và cách tính tuổi của thân, lá, hoa, quả trên cành nguyên vẹn).
+ Xử lí mẫu lá, chia lá thành ba phần theo chiều dọc, cắt lát và nhuộm mẫu bằng thuốc nhuộm kép son phèn lục iod.
+ Làm tiêu bản tạm thời lát cắt ngang lá Tràm, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính x10, x40.
+ Đếm số lượng túi tiết và bó libe gỗ trên tiêu bản. Dùng máy ảnh kĩ thuật số chụp ảnh mẫu vật trên kính hiển vi ở các vật kính khác nhau tùy loại mô.
+ Lập bảng thống kê số lượng túi tiết và bó libe gỗ làm cơ sở so sánh, đánh giá giữa các mẫu thu tại các ô, các khu tại 2 điểm khảo sát bằng phần mềm SPSS.
3.4.3. Phương pháp khảo sát nghiên cứu tế bào (phương pháp Kagava)
Qui trình được tiến hành tại phòng thí nghiệm Thực vật – bộ môn Sư phạm Sinh học – trường Đại học Cần Thơ.
+ Nguồn rễ: rễ được thu từ nhiều nguồn khác nhau: thu rễ trực tiếp bằng cách đào đất và thu rễ non trong lớp mùn; gieo ươm hạt trên đất ẩm và ươm trồng cây non theo phương pháp bán thủy canh.
Hình 6: Các phương pháp để thu mẫu rễ
A. Gieo ươm bằng hạt B. Đào rễ C. Ươm trồng bán thủy canh + Thu mẫu: Khi rễ non ra nhiều, cắt lấy từ chóp rễ trở lên khoảng 1 cm đem xử lí nhược trương. Qua nhiều lần lặp lại thí nghiệm (kết quả cho thấy ở Bảng 7- Phần phụ lục) thì chúng tôi chọn thời gian thu mẫu rễ tốt nhất là khoảng 8 giờ 30 phút đến 9 giờ sáng. Nếu thu mẫu sớm hơn thì tiêu bản thực hiện được có phần lớn tế bào ở kì trung gian, kì đầu. Nếu thu mẫu trễ hơn thì tiêu bản thực hiện được có phần lớn tế bào ở kì sau, kì cuối.
+ Xử lí mẫu vật trong dung dịch nhược trương Natri citrate (C6H5Na3O7): giúp
A B
C
thể quan sát rõ ràng từng chiếc. Dùng dung dịch nhược trương Natri citrate 0,3% và 0,4% để tìm ra nồng độ thích hợp. Cho rễ non có chứa vùng mô phân sinh vào ngâm trong dung dịch nhược trương Natri citrate khoảng 30 – 60 phút trước khi chuyển rễ vào cố định trong dung dịch carnoy.
+ Cố định mẫu vật: Sau khi ngâm mẫu trong dung dịch nhược trương Natri citrate, vớt mẫu ra đặt nhẹ trên giấy thấm cho ráo sau đó để vào dung dịch carnoy, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho mẫu ngấm đều chất cố định. Thời gian bắt đầu cố định tốt nhất từ 9 giờ 30 phút đến 10 giờ sáng. Mẫu được cố định trong thời gian 4 – 6 giờ.
+ Rửa và trữ mẫu trong cồn: Sau thời gian cố định, mẫu được vớt ra khỏi dung dịch cố định carnoy, rửa mẫu bằng cồn 70o nhiều lần đến khi hết mùi Acid acetic, sau đó mẫu được trữ trong cồn 70o.
+ Nhuộm mẫu: cho 5 – 6 mẫu rễ vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt Acetocarmine cho ngập mẫu, ngâm trong khoảng 30 – 60 phút. Sau thời gian ngâm mẫu, hơ ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn khoảng 5 phút đến khi rễ bắt màu đậm và rễ mềm có thể dễ dàng tán mẫu.
+ Thực hiện tiêu bản NST hiển vi tạm thời: Tiêu bản NST được thực hiện bằng phương pháp ép. Sau khi đun rễ trong thuốc nhuộm Acetocarmine, nhỏ một giọt thuốc nhuộm lên lame, đặt một mẫu rễ lên lame. Dùng lưỡi lam cắt lấy phần chóp đầu của rễ dài khoảng 0,1 mm (phần thon nhỏ và có màu hồng đậm của thuốc nhuộm).
Dùng lamelle đậy lên chóp rễ, phủ giấy thấm lên lame, dùng 2 tay giữ mép giấy thấm, tránh làm cho lamelle trượt khỏi vị trí của nó. Dùng cán kim mũi giáo gõ nhẹ từ từ lên tiêu bản ngay vị trí có chóp rễ, gõ từ trong ra ngoài đến khi mẫu tán đều trong tiêu bản và các tế bào được dàn đều ra.
+ Quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học: Tiêu bản sau khi được dàn đều, đặt lên kính hiển vi quan sát. Điều chỉnh vật kính theo độ phóng đại x40 để phát hiện ra nhóm tế bào đang ở kì giữa trong quá trình nguyên phân. Sau đó chỉnh về vật kính x100 để quan sát rõ hình thái và số lượng NST của tế bào. Dùng máy ảnh kĩ thuật số chụp ảnh mẫu vật trên kính hiển vi ở vật kính x100.
+ Quan sát đếm số lượng NST trên ảnh chụp qua kính hiển vi và thống kê kết quả để lập bảng thống kê giá trị trung bình và tính sai số.
3.4.4. Phương pháp phân loại bào tử phấn hoa
Phương pháp này được áp dụng theo phương pháp của Trần Công Khánh (1979) .
A B C
Hình 7: Các giai đoạn phát triển của hoa Tràm A. Nụ non B. Hoa búp C. Hoa nở
- Chọn hoa vừa phải, chọn hoa vừa búp (Hình 7B) để hạt phấn còn nguyên trong túi phấn, thu được hạt phấn một cách dễ dàng. Không chọn hoa quá non hoặc đã nở vì nếu chọn nụ hoa còn quá nhỏ (Hình 7A) thì tiêu bản phấn hoa quan sát được có kích thước rất nhỏ, chưa phân biệt rõ hình dạng giữa các hạt phấn. Nếu chọn hoa đã nở (Hình 7C) thì khi đó túi phấn đã khai và hạt phấn đã tung ra ngoài nên không thu được hạt phấn để tiến hành thí nghiệm.
- Đặt hoa Tràm lên lame. Dùng kim mũi giáo tách lấy hạt phấn từ hoa Tràm vừa búp. Sau khi tách được hạt phấn đặt trên lame, nhỏ vài giọt Natri hydroxit lên vùng có chứa hạt phấn rồi đun nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn cho giọt Natri hydroxit sôi nhẹ 3 lần.
- Đậy lamelle và quan sát dưới kính hiển vi.
- Xác định hình dạng ngoài, cấu trúc của hạt phấn. Dùng máy ảnh kĩ thuật số chụp ảnh hình dạng ngoài hạt phấn trên kính hiển vi ở vật kính x60 hoặc x100.