I.3. GIÁM SÁT VÀ QUẢN LÝ SỰ NỞ HOA CỦA TẢO
I.3.1. Cỏc phương phỏp nghiờn cứu ủộc tớnh và ủộc tố của vi khuẩn lam
I.3.1.1. Phương phỏp phõn tớch ủộc tố bằng sắc kớ lỏng cao ỏp
Phương phỏp phõn tớch ủộc tố bằng sắc kớ lỏng cao ỏp - High performance liquid chromatography (HPLC) thường dựng ủể xỏc ủịnh rất nhiều loại ủộc tố, trong ủú cỏc ủộc tố VKL phổ biến như microcystins và nodularins không là ngoại lệ. Nguyên tắc của phương pháp là tách dịch chiết ủó hoặc chưa ủược làm sạch trước ủú trờn cột pha rắn (gồm những hạt cực
từ cột chảy ra ủược phỏt hiện bằng quang phổ. Núi chung ủộc tố của VKL thường khụng phải là chất huỳnh quang do vậy chỳng thường ủược dẫn xuất hoỏ. Tuy nhiờn việc nhận dạng những microcystins ủặc biệt mà chủ yếu dựa vào thời gian lưu trên cột có xu hướng gây nhầm lẫn, mặt khác khó có thể tạo ủược một thư viện phổ ủể xỏc ủịnh hơn 80 loại microcystins khỏc nhau. Hơn nữa việc ủầu tư cho thiết bị phõn tớch cũng khỏ ủắt. ðõy cũng là một trong rất nhiều yếu tố giới hạn khi sử dụng phương phỏp này ủể xỏc ủịnh microcystins chưa biết. Phương pháp sắc kí ghép nối khối phổ (LC/MS) là phương pháp ủỏp ứng yờu cầu này vỡ nú cú thể tỏch, ủồng thời nhận dạng microcystins trong hỗn hợp. Kết quả, MS như dấu ấn (fingerprint) ủể nhận dạng microcystins qua cỏc mẫu chuẩn. Nhược ủiểm của phương phỏp này là ủầu tư thiết bị rất tốn kém và phải xử lý mẫu thật sạch trước khi tiến hành phân tích [25].
I.3.1.2. Các phương pháp sinh hoá
Phương pháp ức chế enzyme phosphatase (protein phosphatase inhibator) là phương phỏp sàng lọc khỏ nhạy ủối với microcystins và nodularins, sử dụng hoạt tớnh sinh hoỏ của ủộc tố. Phương phỏp này dựa trờn quỏ trỡnh ủịnh lượng 32P giải phúng từ cơ chất ủỏnh dấu phúng xạ nhờ hoạt tính của protein phosphatase 1 và 2A. ðây là phương pháp nhậy, cho phép xỏc ủịnh microcystins ở mức ủộ thấp và cú thể tiến hành phõn tớch nhiều mẫu trong cựng một thời ủiểm. Trong thực tế, ứng dụng phương phỏp này rất khú vỡ việc sử dụng phúng xạ ủũi hỏi phải cú những quy ủịnh an toàn và thiết bị ủặc biệt. Một phương phỏp khỏc là phương phỏp ức chế protein bằng so mầu.
Phương phỏp này trỏnh ủược việc sử dụng cỏc vật liệu phúng xạ và rất cú hiệu quả ủể nhận dạng hoạt tớnh sinh học của microcystins trong mẫu tự nhiờn [25].
I.3.1.3. Phương pháp miễn dịch
Phương pháp hấp thụ miễn dịch enzyme liên kết (ELISA) là phương phỏp ủầy triển vọng ủể sàng lọc nhanh microcystins, do ủộ nhạy, tớnh ủặc hiệu và dễ thao tỏc. Kĩ thuật ELISA là cụng cụ khỏ phổ biến trong việc xỏc ủịnh ủộc tố. Nguyờn lý cơ bản của kỹ thuật dựa trờn huyết thanh khỏng thể ủa dũng thỏ chống lại BSA (Bovin Serum Albumin) gắn microcystins-LR. Huyết thanh này cho phản ứng chéo mạnh với microcystins-LR, -YR, -RR và nodularins; nhưng yếu hơn so với microcystins –LY và –LA. ðộ nhạy của phương phỏp khoảng 50% gắn kết với nồng ủộ ủộc tố là 1ng/ml. Phương phỏp này thớch hợp với việc kiểm tra ủộc tố VKL trong nước. Trờn thực tế phương phỏp ủược ứng dụng khỏ thành cụng trong ủịnh lượng ủộc tố VKL tại cỏc vùng cung cấp nước sinh hoạt và dịch chiết sinh khối tảo, với giới hạn phát hiện lần lượt 0,2 àg.L-1 và 0,25àg.L-1 cho mẫu nước và sinh khối [25].
I.3.1.4. Các phương pháp sinh học
I.3.1.4.1. Phương pháp thử sinh học trên chuột
Là phương phỏp quen thuộc và thụng thường nhất ủể nghiờn cứu ủộc tính VKL. Trong phương pháp này, chuột nhắt trắng, có trọng lượng khoảng 20-25g ủược tiờm 0,1-1mL dịch chiết VKL ủó khử trựng dưới màng bụng.
Sau ủú, thớ nghiệm ủược theo dừi 24 giờ và quan sỏt cỏc mụ sau khi chuột chết. Nếu trong mẫu tảo nghi là cú cylindrospermopsin thỡ giai ủoạn quan sỏt cú thể kộo dài tới 7 ngày. ðộc tố này gõy hư hại ủỏng kể cỏc cơ quan, ủặc biệt là gan và thận.
Bảng 3: Mối tương quan giữa giỏ trị LC50 với ủộc tớnh của VKL [21]
LC50 ðộc tính
>1000 mg Khụng ủộc 500-1000 mg ðộc tính thấp
100-500 mg ðộc tính bình thường
<100 mg ðộc tính cao
ðộc tớnh ủược thể hiện bằng giỏ trị LC50 -nồng ủộ gõy chết 50% chuột thớ nghiệm. Theo Lawton và cs, 1994 ủộc tớnh xỏc ủịnh theo cỏc giỏ trị LC50 ủược trỡnh bày trờn Bảng 3. Ở một vài nước, giới hạn khụng ủộc ớt nhất là 2000 mgTLK/kg chuột [21, 25].
I.3.1.4.2. Phương phỏp thử sinh học trờn ủộng vật khụng xương sống Nhiều ủộng vật khụng xương sống như một số loài giỏp xỏc Artemia salina, Daphnia pulex, D.lumholtzi, muỗi và ấu trùng muỗi, ruồi nhà trưởng thành, chõu chấu, ruồi dấm,… là ủối tượng sử dụng trong phộp thử sinh học ủể nghiờn cứu ủộc tớnh của VKL. Những loài ủộng vật khụng xương sống này tỏ ra khỏ nhạy với ủộc tố của VKL. Tuy nhiờn nhược ủiểm của phương phỏp là những hạn chế trong thao tỏc thớ nghiệm. Artemia salina là ủối tượng ủược sử dụng nhiều năm nay ủể xỏc ủịnh cỏc chất trao ủổi chất thứ cấp cú ủộc tớnh.
Hiện nay Artemia salina ủược bỏn trờn thị trường ở dạng kit thử chuẩn. Trứng của Artemia có thể bảo quả trong nhiều năm ở 20oC mà không bị mất hoạt tớnh và dễ dàng nở thành cỏ thể trưởng thành ủể sử dụng trong thớ nghiệm kộo dài 20- 30h [21, 25].
I.3.1.4.3. Phương pháp thử sinh học trên vi khuẩn
Hiện nay một phép thử sinh học trên vi khuẩn có khả năng phát sáng là Photobacterium phosphoreum còn gọi là phép thử Microtox bioluminescence assay ủang ủược chỳ ý ủến. Trong phộp thử này, sự phỏt sỏng của vi khuẩn thớ nghiệm giảm dần khi xử lý bằng dịch chiết cú chứa ủộc tố tảo [21, 25].
I.3.1.4.4. Phương phỏp sử dụng tế bào ủộng vật cú vỳ
Mới ủõy, do luật hạn chế sử dụng chuột làm ủộng vật thớ nghiệm ở một số nước trờn thế giới, nhiều nghiờn cứu ủó sử dụng tế bào của ủộng vật cú vỳ như tế bào gan chuột, tế bào nguyên bào sợi (fibroblast), tế bào máu, tế bào thần kinh gốc (neuroblastoma) ủể nghiờn cứu ủộc tớnh của ủộc tố VKL. Kết
quả thu ủược từ những phương phỏp này tương ủồng với kết quả nghiờn cứu ủộc tớnh VKL sử dụng phương phỏp thử sinh học trờn chuột [21, 25].