II.3.1. Phương pháp thu mẫu ngoài hiện trường
+ Thu mẫu sinh khối vi tảo: Mẫu sinh khối vi tảo nổi ủược vớt bằng vợt số N075, kộo nhiều lần theo phương nằm ngang. Nếu cú vỏng tảo dầy ủặc thỡ vớt trực tiếp bằng gỏo. Mẫu ủược ủựng trong chai nhựa, dung tớch 1lớt.
+ Thu mẫu ủịnh tớnh thực vật (phytoplankton). Mẫu vi tảo ủược thu bằng vợt số N075, kộo nhiều lần theo phương nằm ngang. Mẫu thu ủược ủựng trong lọ và cố ủịnh trong foocmon 50% hoặc dung dịch Lugol.
+ Thu mẫu ủịnh lượng thực vật: Mẫu ủịnh lượng ủược thu bằng sụ nhựa cú thể tớch 5 lớt (lấy 10 lần) và ủược lọc qua lưới số N075. Mẫu cụ ủặc ủược ủựng trong hộp nhựa dung tớch 100mL và ủược cố ủịnh ngay bằng foocmon 50% hoặc dung dịch Lugol.
III.3.2. Phương phỏp ủịnh loại tảo
ðể tiến hành ủịnh loại tảo, chỳng tụi sử dụng phương phỏp so sỏnh hỡnh thỏi dưới kớnh hiển vi, sử dụng trắc vi vật kớnh và trắc vi thị kớnh ủể ủo kớch thước trung bình của tế bào tảo. Quan sát chi tiết và mô tả chúng bằng hình vẽ. Sau ủú xỏc ủịnh loài bằng một số tài liệu chớnh sau:
- Phân loại VKL ở Việt Nam (1996) [7].
- Khu hệ tảo các thuỷ vực nước ngọt ở Việt Nam [6].
- Dẫn liệu khu hệ tảo nước ngọt miền Bắc Việt Nam [12].
II.3.3. Phương pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam
Quy trỡnh phõn lập ủược tiến hành theo phương phỏp Shirai cú cải tiến [10]. Quá trình phân lập và nuôi cấy VKL sử dụng môi trường CB và môi trường Z8 [2, 10].
Cỏc khuẩn lạc từ mẫu nước hồ nở hoa ủược gắp ra dưới kớnh hiển vi và chuyển vào mụi trường thạch trong cỏc ủĩa petri (0,6% thạch trong mụi trường) ủược bọc kớn và ủặt dưới ỏnh ủốn, ỏnh sỏng từ 2000-3000 lux ở 25- 300C trong vũng 1- 2 tuần. Những khuẩn lạc phỏt triển ủược kiểm tra dưới kớnh hiển vi ủối pha ủể xỏc ủịnh sự lõy nhiễm. Cỏc khuẩn lạc sạch ủược chuyển sang nuụi cấy trong ống nghiệm, sau ủú là bỡnh tam giỏc 50 mL, 250 mL, 500 mL trong mụi trường lỏng ở ủiều kiện trờn ủể thu sinh khối; ủụng khụ sử dụng trong cỏc nghiờn cứu ủộc tớnh và xỏc ủịnh ủộc tố tiếp theo. Nếu khuẩn lạc bị nhiễm thỡ quỏ trỡnh phõn lập quay lại từ ủầu [2, 10].
II.3.4. Phương phỏp xỏc ủịnh ủộc tớnh của vi khuẩn lam ủộc II.3.4.1. Phương phỏp chiết ủộc tố
Cõn vào mỗi ống eppendorf (2mL) 50mg mẫu sinh khối tảo ủó ủụng khụ. Thờm vào mỗi ống eppendorf 1mL methanol 80%, trộn ủều bằng mỏy voltex. Phỏ vỡ tế bào bằng bể siờu õm trong 30 phỳt. ðể mẫu qua ủờm ở nhiệt ủộ 40C. Ly tõm ở 12000 vũng/ phỳt ở 100C trong 10 phỳt.
Dựng pipetman, hỳt lấy phần dịch trong, ủưa sang ống eppendorf khỏc, loại bỏ sinh khối, sau ủú bổ sung 1mL methannol 70% và lặp lại thao tỏc như trờn 3 lần. Phần dịch trong thu ủược, giàn ủều vào 2 eppendorf rồi tiếp tục ly tõm ở 12000 vũng/phỳt ở 100C trong 10 phỳt ủể loại bỏ hoàn toàn sinh khối.
Sau khi ủó loại hoàn toàn sinh khối, dịch trong ủược sấy khụ ở 400C trong tủ sấy chõn khụng, rồi bảo quản trong ủiều kiện lạnh ớt ỏnh sỏng [5, 21].
II.3.4.2. Phương phỏp thử ủộc tớnh trờn Artemia salina + Chuẩn bị dịch chiết tảo
Hoà tan cặn từ cỏc ống chứa ủộc tố ủó ủược chiết ở trờn bằng 1,25mL nước biển (tương ủương 50mg tảo khụ/1,25 mL nước biển hay 40mg tảo khô/1mL nước biển) ta có dịch chiết 1 (dung dịch mẹ). Nếu cặn không hoà tan hoàn toàn thì phải tiến hành ly tâm làm trong. Từ dịch chiết mẹ này pha loóng nước biển thành cỏc dịch chiết cú nồng ủộ 32 – 24 – 16 - 8 – 4 – 1 mg tảo khô/mL [12, 21].
+ Ấp trứng Artemia salina
Cân 1mg trứng cho vào trong 50mL nước biển, nuôi ở 250C (có sục khí). sau 40-48h trứng nở thành con Artemia salina.
Sục ủều Artemia salina trong lọ. Dựng nước biển pha loóng sao cho mỗi 0.1mL này chứa khoảng 10-20 con.
Cho vào mỗi giếng microplate 0,1 mL nước biển chứa Artemia salina (10-20 con) và 0.1mL dịch chiết tảo, mỗi nồng ủộ tiến hành 3 lần lặp lại.
Tiến hành thớ nghiệm với cỏc nồng ủộ 40 – 32 – 24 – 16 – 8 – 4 – 1 – 0 mg tảo khô/mL.
Theo dừi và ủếm số Artemia salina chết sau 18h, 20h, 22h, 24h; sau ủú cố ủịnh toàn bộ số Artemia salina bằng vài giọt foocmon 50%, ủếm số con chết. Lỳc này ta sẽ cú tổng số Artemia salina trong mỗi giếng, từ ủú tớnh ủược tỉ lệ phần trăm chết theo nồng ủộ dịch chiết tảo [5, 21].