ðể chủ ủộng sinh khối cho cỏc nghiờn cứu sõu hơn, chỳng tụi ủó tiến hành phân lập một số chủng vi tảo có mặt trong hồ Núi Cốc và hồ Hoàn Kiếm, kết quả cho thấy: với quỏ trỡnh phõn lập ủó ủược mụ tả trước ủõy [10], Hai chủng thuộc loài VKL Microcystis aeruginosa kí hiệu là M. aeruginosa NC (hỡnh 14) và M. aeruginosa HK (hỡnh 15) ủó ủược phõn lập.
Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy hình dạng và kích thước của 2 chủng thuộc loài Microcystis aeruginosa như sau:
Chủng Microcystis aeruginosa NC: Phân lập từ mẫu nước nở hoa hồ Núi Cốc. Hình thành những tập đồn vững chắc, gồm nhiều tế bào hình cầu trong một khối nhày với hỡnh dạng ủa dạng, kớch thước tế bào từ 3-5àm, cú thể nhìn rõ khơng bào khí. Dạng tập đồn cĩ màu xanh lam; khi nuơi cấy trong phòng thí nghiệm, các tế bào thường liên kết với nhau chặt chẽ và nổi trên bề mặt.
Hỡnh14: Chủng Microcystis aeruginosa NC phõn lập ủược tại hồ Nỳi Cốc, Thái Nguyên
Chủng Microcystis aeruginosa HK: phân lập từ mẫu nước nở hoa hồ Hồn Kiếm. Chúng tồn tại ở dạng tập đồn hình trịn hoặc hình oval màu
xanh lam, các tế bào liên kết chặt chẽ với nhau và nổi trên bề mặt trong môi trường khi nuơi cấy. Tế bào dạng đơn lẻ hoặc ghép đơi trong tập đồn, hình cầu, kớch thước từ 3-5àm.
Hỡnh 15: Chủng M.aeruginosa HK phõn lập ủược từ hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội Các chủng Microcystis aeruginosa nêu trên rất gần với mô tả của GS.TSKH Dương ðức Tiến (1996) về Microcystis aeruginosa Kutz. Microcystis aeruginosa Kutz thuộc chi Microcystis, họ Microcystidaceae, bộ Chroococcales ngành VKL (Cyanobacteria). Tập đồn cĩ hình cầu hoặc hình trứng, trong một khối nhầy cĩ giới hạn rõ. Các tế bào trong tập đồn hình cầu, ủường kớnh 3-7àm, chứa ủầy khụng bào khớ, thường ủược sắp xếp dày ủặc trong tập đồn. Taxon này tạo nên sự nở hoa của các thủy vực và thường phân bố trong cỏc thủy vực nước ủứng hoặc nước chảy chậm, gặp nhiều trong tất cả cỏc loại hồ ủầm, ao vựng ủồng bằng [4, 7].
ðể phục vụ quỏ trỡnh nghiờn cứu về ủộc tớnh của VKL bằng phương phỏp thử sinh học trờn Artemia salina, ngoài hai chủng ủó phõn lập và mụ tả ở trên, một số chủng khác có kí hiệu Anabaena HK, Oscillatoria limosa, O.lemmermannii, O.acuta, Spirulina platensis và các mẫu nước nở hoa tại hồ Triều Khúc, ao Chùa Giàn, hồ Hoàn Kiếm, hồ Núi Cốc, Hồ Văn (kí hiệu lần
III.3. NGHIÊN CỨU TỈ LỆ CHẾT CỦA Artemia salina THEO THỜI GIAN
Phương pháp thử sinh học trên Artemia salina là một phương pháp thử ủộc tớnh cũn khỏ mới mẻ ở Việt Nam. ðể cú ủược phương phỏp hoàn thiện và dễ áp dụng trong thực tiễn, việc nghiên cứu tỉ lệ chết của Artemia salina theo thời gian nhằm tỡm hiểu mức ủộ ủộc của ủộc tố chiết từ tảo là rất cần thiết.
Kết quả nghiờn cứu ủược trỡnh bày cụ thể trờn hỡnh 16 cho thấy:
Ana HK
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(m g tảo khụ/m l) Tỉ lệ chết artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
Ma HK
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(mg tảo khụ/ml) Tỉ lệ chết Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
Ma NC ðK
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina(%)
18h 20h 22h 24h
Ma NC ðK
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina(%)
18h 20h 22h 24h
Spirulina
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết của Artemia salina%
18h 20h 22h 24h
Spirulina tươi
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina 18h
20h 22h 24h
Hình 16: ðường cong tỉ lệ chết của Artemia salina theo thời gian thí nghiệm ở một số mẫu phân lập
Với mẫu Anabaena phân lập từ hồ Hoàn Kiếm, tỉ lệ chết của Artemia salina tăng dần cựng với nồng ủộ dịch chiết tảo (0- 20 mg tảo khụ/mL) và khụng cú biến ủộng lớn tại cỏc thời ủiểm khỏc nhau. Tại ngưỡng nồng ủộ tảo thấp (0- 4 mg tảo khô/mL), tỉ lệ chết của Artemia salina rất thấp và không có sự sai khác giữa các thời gian thí nghiệm. Tỉ lệ chết của Artemia salina tăng nhanh từ nồng ủộ 4- 12 mg tảo khụ/mL và tương ủối ổn ủịnh ở mức nồng ủộ dịch chiết tảo cao (từ 12- 20 mg tảo khụ/mL). Với nồng ủộ dịch chiết tảo cao nhất (20 mg tảo khô/mL), tỉ lệ chết của Artemia salina là 100% ở tất cả các thời ủiểm thớ nghiệm.
Cũng ủược phõn lập từ mẫu nước nở hoa hồ Hoàn Kiếm nhưng khi nghiờn cứu về ủương cong tỉ lệ chết của Artemia salina phụ thuộc dịch chiết VKL trên mẫu M.aeruginosa HK cho thấy có sự khác biệt rất lớn. ðường cong tỉ lệ chết của Artemia salina theo thời gian của mẫu này thấp và ổn ủịnh tại dải nồng ủộ 0- 2 mg tảo khụ/ml, nhưng lại tăng rất nhanh ở dải nồng ủộ 2- 4 mg tảo khụ/mL, tăng chậm ở nồng ủộ 8-16 mg tảo khụ/mL. Với nồng ủộ dịch chiết tảo cao (16- 20 mg tảo khô/mL), tỉ lệ chết của Artemia salina là 100% ở tất cả cỏc thời ủiểm thớ nghiệm.
Cũng cùng thuộc loài M.aeruginosa, mẫu M.aeruginosa NC có sự khác biệt tương ủối lớn so với M.aeruginosa HK. Tại dải nồng ủộ dịch chiết tảo từ 0- 12 mg tảo khụ/mL, tỉ lệ chết của Artemia salina tỉ lệ thuận với nồng ủộ tảo.
Trong dải nồng ủộ này, ủường cong phụ thuộc nồng ủộ dịch chiết tảo chia làm 2 nhóm: nhóm 18 giờ, 20 giờ và nhóm 22 giờ, 24 giờ. Không có sự khác biệt lớn về tỷ lệ chết của Artemia salina trong một nhóm nhưng lại khác biệt tương ủối lớn giữa 2 nhúm. Nhúm tại thời ủiểm 22 giờ và 24 giờ cú tỉ lệ chết của Artemia salina cao hơn nhúm kia. Tại dải nồng ủộ dịch chiết tảo khỏc (từ 12- 20 mg tảo khụ/mL) ủường cong phụ thuộc nồng ủộ dịch chiết tảo tương tự nhau ở tất cả cỏc thời ủiểm nghiờn cứu (tỉ lệ chết của Artemia salina ủều ủạt 100%).
Tỉ lệ chết của Artemia salina phụ thuộc dịch chiết của tảo Spirulina plantesis ở tất cả cỏc thời ủiểm nghiờn cứu là như nhau và trựng gốc tọa ủộ.
Gần như khụng cú nồng ủộ dịch chiết nào gõy chết Artemia salina thớ nghiệm.
Ngoài một số chủng ủược phõn lập ở trờn, một số chủng phõn lập khỏc thuộc chi Oscillatoria cũng ủược sử dụng. ðõy là những loài vi tảo nước nợ, ủược phõn lập từ cỏc ủầm ao nuụi tụm. Chỳng gồm 3 loài: O.acuta kớ hiệu Osp1, O.lemmermanii kí hiệu Osp2 và O.limosa. Nghiên cứu tỉ lệ chết của Artemia salina trên dịch chiết của các chủng này, cho thấy:
Osp1
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(mg tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chêt Artemia salina(%)
18h 20h 22h 24h
Osp2
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
O.limosa ðK
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (mg tảo khụ/ml)
Tỉ lệ chết Artemia salina
18h 20h 22h 24h
Hình 17: ðường cong tỉ lệ chết của Artemia salina theo thời gian thí nghiệm ở một số mẫu phân lập thuộc chi Oscillatoria
Với chủng Osp1, tỉ lệ chết Artemia salina tỉ lệ thuận với nồng ủộ dịch chiết tảo và khụng cú biến ủộng lớn tại cỏc thời ủiểm khỏc nhau.Tại nồng ủộ dịch chiết tảo lớn nhất (20 mg tảo khụ/mL), ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina ở cỏc thời ủiểm nghiờn cứu ủều khụng ủạt cực ủại. Thờm vào ủú, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina ở thời ủiểm 22 giờ và 24 giờ cao hơn so với cỏc ủường cong cũn lại.
Có sự khác biệt lớn giữa mẫu Osp1 và Osp2. ðường cong tỉ lệ chết Artemia salina với dịch chiết mẫu Osp2 có xu hướng cao hơn và có sự biến ủộng lớn ở những thời ủiểm nghiờn cứu khỏc nhau. Cỏc ủường cong này phõn làm 3 nhúm: Nhúm thời ủiểm 18 giờ với 20 giờ, nhúm 22 giờ và nhúm 24 giờ. Tại nhúm thời ủiểm 18 giờ và 20 giờ, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina cú xu hướng ủi lờn tại nồng ủộ dịch chiết 20 mg tảo khụ/mL nhưng khụng ủạt cực ủại (tỉ lệ chết dưới 100%). Trong khi ủú, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina ở thời ủiểm 22h cú xu hướng tăng nhanh ở dải nồng ủộ dịch chiết tảo từ 2 mg tảo khụ/mL ủến 12mg tảo khụ/mL và tại dải nồng ủộ trờn 12mg/mL ủường cong ủạt cực ủại (tỉ lệ chết ủạt 100%). Cũng với xu hướng như vậy, tại thời ủiểm 24 giờ, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina cú xu hướng ủi lờn rất nhanh ở dải nồng ủộ dịch chiết tảo từ 2- 4 mg tảo khụ /mL và ủạt cực ủại ở nồng ủộ dịch chiết 4- 20 mg tảo khụ/mL.
Trong dải nồng ủộ dịch chiết từ 2- 16 mg tảo khụ/mL, cỏc ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina lên dịch chiết tảo O.limosa tỉ lệ thuận với nhau.
Ở những dải nồng ủộ dịch chiết tảo cao (16-20 mg tảo khụ/mL ), cỏc ủường cong này cú xu hướng ủi ngang do ủạt cực ủại (tỉ lệ chết là 100%).
Mẫu vi tảo phân lập là mẫu chỉ có duy nhất một loài tảo, nhưng với những mẫu nước nở hoa ngoài tự nhiên bao gồm một hay nhiều quần thể vi sinh vật. Do vậy, những kết quả nghiên cứu về tỉ lệ chết của Artemia salina lên dịch chiết của các mẫu nước nở hoa có rất nhiều khác biệt.
Bloom KH 14.04.09
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
bloom HK14.04.09 tươi
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina( %)
18h 20h 22h 24h
Bloom HK 08.12.09
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo(m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chêt Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
bloom HK 22.01.10
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina(%)
18h 20h 22h 24h
Hình18: ðường cong tỉ lệ chết của Artemia salina theo thời gian thí nghiệm ở mẫu nước nở hoa hồ Hoàn Kiếm
Kết quả phân tích cho thấy: Với mẫu nước nở hoa hồ Hoàn Kiếm 14.04.09, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina lờn dịch chiết cú xu hướng tăng dần ủều ở nồng ủộ 0 – 8 mg tảo khụ/mL. Trong khoảng nồng ủộ tảo cao hơn (từ 8 – 20 mg tảo khụ/mL), tỉ lệ chết của Artemia salina ủạt cực ủại (100% chết). Không có sự khác biệt nhiều giữa các thời gian thí nghiệm trong dải nồng ủộ (4 – 20 mg tảo khụ/mL).
Cú sự khỏc biệt ủỏng kể giữa mẫu nước nở hoa hồ Hoàn Kiếm ngày 14.04.2009 và 08.12.2009. Cỏc ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina vào dịch chiết mẫu ngày 08.12.2009 ủều hơn ở dải nồng ủộ thấp (từ 0- 12 mg tảo khụ/ml), nhưng trong dải nồng ủộ cao (từ 12- 16 mg tảo khụ/mL) thỡ cú xu hướng tăng dần ủều và ở khoảng nồng ủộ dịch chiết cao hơn 16 mg tảo khụ/ml tỉ lệ Artemia salina chết là 100%. Ở cỏc thời ủiểm khỏc nhau khụng có sự khác biệt lớn giữa về tỉ lệ chết Artemia salina tuy nhiên tỉ lệ chết của Artemia salina ở 24 giờ cao hơn so với cỏc thời ủiểm thớ nghiệm khỏc.
Với mẫu nước nở hoa hồ Hoàn kiếm thu ủược ngày 22.01.2010, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina tỉ lệ thuận với nồng ủộ dịch chiết tảo và chia làm 2 nhúm khỏ rừ rệt. Nhúm thứ nhất (thời ủiểm 22 và 24 giờ), tỉ lệ chết của Artemia salina tăng trong dải nồng ủộ từ 0- 4 mg tảo khụ/mL và tại dải nồng ủộ cao hơn 4mg/mL thỡ ủạt cực ủại (tỉ lệ chết ủạt 100% Artemia salina thớ nghiệm). Nhúm thứ 2 (thời ủiểm 18 và 20 giờ), tỉ lệ chết Artemia salina tăng trong dải nồng ủộ từ 0- 8 mg tảo khụ/ mL và tại dải nồng ủộ cao hơn (từ 8- 20 mg tảo khụ/mL) thỡ tỉ lệ này cũng ủạt cực ủại. Cũng như 2 mẫu nước nở hoa ở trờn, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina ở 24 giờ cao hơn so với cỏc ủường cong ở tại những thời ủiểm thớ nghiệm khỏc (18 giờ, 20 giờ và 22 giờ).
Bloom HV 23.02.07
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (mg tảo khụ/ml) Tỉ lệ chết Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
Bloom TK 02.02.07
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng dộ dịch chiết tảo (mg tảo khô/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
Bloom ao chùa giàn 17.02.07
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (mg tảo khụ/ml) Tỉ lệ chết Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
Bloom ao chùa giàn 28.03.07
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (m g tảo khụ/m l)
Tỉ lệ chết Artemia salina (%)
18h 20h 22h 24h
Hình 19: ðường cong tỉ lệ chết của Artemia salina theo thời gian thí nghiệm ở một số mẫu nước nở hoa năm 2007
Một số mẫu nước nở hoa khác như: mẫu nước nở hoa hồ Văn, hồ Triều Khỳc, ao Chựa Giàn cũng ủược sử dụng cho nghiờn cứu này. Với mẫu nước
thuận với nồng ủộ dịch chiết tảo. Thời ủiểm 18 giờ, 20giờ và 22 giờ, những ủường cong này cú xu hướng tăng dần ủều với nồng ủộ dịch chiết. Nồng ủộ 20 mg tảo khụ /mL khụng ủủ ủể làm chết 100% Artemia salina thớ nghiệm.
Tại thời ủiểm 24 giờ, trong khoảng nồng ủộ dịch chiết từ 16- 20 mg tảo khụ/mL, tỉ lệ chết của Artemia salina ủạt cực ủại. .
Theo một số ghi chép tại hồ Triều Khúc, Thanh Xuân, HN, hiện tượng nở hoa vào thời ủiểm thỏng 2 năm 2007. Quan sỏt thấy vỏng tảo màu xanh nổi lờn trờn bề mặt xung quanh hồ và cú mựi khỏng sinh ủậm ủặc, cỏ chết nổi lờn trờn bề mặt. Khi tiến hành nghiờn cứu, ủường cong tỉ lệ chết Artemia salina tỉ lệ thuận với nồng ủộ dịch chiết tảo và khụng cú biến ủộng lớn tại cỏc thời ủiểm khỏc nhau.Tại dải nồng ủộ từ 0- 4 mg tảo khụ/mL, tỉ lệ chết của Artemia salina khụng ủỏng kể. Tỉ lệ chết của Artemia salina tăng nhanh trong dải nồng ủộ 4- 8 mg tảo khụ/mL, trong khi ủú tỉ lệ chết của Artemia salina tương ủối ổn ủịnh ở mức cao khi nồng ủộ dịch chiết tảo từ 8- 20mg tảo khụ/mL. Tại nồng ủộ dịch chiết tảo lớn nhất (20 mg tảo khụ/ml), tỉ lệ chết của Artemia salina khụng ủạt 100%.
Tương tự như vậy, khi tiến hành nghiên cứu tại mẫu nước nở hoa ao Chựa Giàn vào thời ủiểm thỏng 2 và thỏng 3 năm 2007, tỉ lệ chết của Artemia salina cũng tỉ lệ thuận với nồng ủộ dịch chiết tảo và ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina ở thời ủiểm 24 giờ cao hơn so với cỏc thời ủiểm cũn lại. Riờng trong mẫu nước nở hoa tại thời ủiểm thỏng 2, nồng ủộ dịch chiết tảo 20 mg tảo khô/mL không làm chết 100% Artemia salina thí nghiệm. Nhưng ở mẫu nước nở hoa tại tháng 3, tỉ lệ Artemia salina thí nghiệm chết 100% ngay ở nồng ủộ từ 8- 20 mg tảo khụ/mL tại thời ủiểm 24 giờ. Cũn ở cỏc thời ủiểm khỏc, nồng ủộ cao nhất của nghiờn cứu cũng khụng ủủ ủể làm chết 100%
Artemia salina thí nghiệm.
Bloom NC 12.08.09
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (m g tảo khụ/m l) Tỉ lệ chết Artemia salina( %)
18h 20h 22h 24h
Bloom NC 05.10.09
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20 25
Nồng ủộ dịch chiết tảo (mg tảo khụ/ml)
Tỉ lệ chết Artemia (%)
18h 20h 22h 24h
Hình20: ðường cong tỉ lệ chết của Artemia salina theo thời gian thí nghiệm ở mẫu nước nở hoa hồ Núi Cốc
Vào thời ủiểm thỏng 8 ủến thỏng 10 năm 2009 tại hồ Nỳi Cốc xuất hiện hiện tượng nở hoa nước, váng tảo mầu xanh tập chung ở cuối hướng gió. Khi tiến hành nghiờn cứu ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina trong những mẫu nước nở hoa này, ta thấy: ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina tỉ lệ thuận với nồng ủộ tại dải nồng ủộ 0- 8 mg tảo khụ/mL và chia làm 2 nhúm là nhúm 18 giờ, 20 giờ và nhúm 22 giờ, 24 giờ, ủường cong tỉ lệ chết Artemia salina không có sự khác biệt lớn trong một nhóm nhưng lại khác biệt tương ủối lớn giữa 2 nhúm, nhúm 22 giờ, 24 giờ cú tỉ lệ chết của Artemia salina cao hơn ở nhúm cũn lại. Tại dải nồng ủộ lớn hơn (từ 8- 20 mg tảo khụ/mL) ủường cong tỉ lệ chết Artemia salina ủạt cực ủại (tỉ lệ chết ủạt 100%) tại tất cả cỏc thời ủiểm.
Với mẫu nở hoa thỏng 10 kết quả ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina thu ủược cũng tương tự như với mẫu nước nở hoa vào thỏng 8 tại cỏc thời ủiểm 20, 22, 24 giờ. Tuy nhiờn tại thời ủiểm 18 giờ cú sự khỏc biệt nhưng khụng lớn, ủường cong tỉ lệ chết của Artemia salina thớ nghiệm tỉ lệ thuận với nồng ủộ dịch chiết và khụng ủạt ủược cực ủại tại tại nồng ủộ dịch chiết tảo là lớn nhất (20 mg tảo khô/mL).
Qua những kết quả trên cho thấy tỉ lệ chết của Artemia salina thí
ủiểm 24 giờ tỉ lệ Artemia salina thớ nghiệm chết là cao nhất so với cỏc thời ủiểm khỏc.
Dựa trờn kết quả này tụi tiến hành tiếp nghiờn cứu ủộc tớnh của cỏc mẫu VKL phõn lập và mẫu nước nở hoa bằng giỏ trị LC50 tại thời ủiểm 24 giờ.