Xác định hàm lƣợng và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanins

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.5 Xác định hàm lƣợng và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa của anthocyanins

 Xác định độ ẩm nguyên liệu

Độ ẩm đƣợc xác định bằng máy đo độ ẩm. Các thông số cài đặc cho máy: Nhiệt độ: 105oC và thời gian là 0,0 min.

Các thí nghiệm đƣợc thực hiện nhiều lần rồi lấy kết quả trung bình.

Bã **

Chiết

Lọc

Dịch lọc

Phần 1 Phần 2

Lắc mạnh, dọc theo thành ống

nghiệm

Bọt bền

saponin

Xanh đen CH3COONa

FeCl3 10%

Tannin

 Xác định hàm lƣợng anthocyanins trong dịch chiết nguyên liệu Sơ đồ chiết dịch:

Sơ đồ 2.4: Quy trình tách chiết anthocyanins Hóa chất:

Dung dịch đệm pH=1: Hòa tan hoàn toàn 1,86 g KCl vào 980 ml nước cất trong becher. Đo và chỉnh pH về 1 bằng dung dịch HCl 20 %.

Dung dịch đệm pH=4,5: Hòa tan hoàn toàn 54,43 g CH3COONa.3H2O vào 960 ml nước cất trong becher. Đo và chỉnh pH về 4,5 bằng dung dịch HCl 20%.

Các dung dịch đệm đƣợc bảo quản trong chai kín ở nhiệt độ phòng, sử dụng đƣợc trong nhiều tháng. Trước khi sử dụng nên kiểm tra và chỉnh về đúng pH của phép đo.

Thiết bị

Máy đo quang phổ hấp thu UV-Vis, gồm: Nguồn sáng bằng đèn thạch anh-iod cho phổ ở vùng khả kiến; Bộ phận phân tách ánh sáng tách các bức xạ do nguồn sáng cung cấp thành các chùm tia đơn sắc lần lƣợc đi qua cuvet chứa dung môi và chứa mẫu;

Detector thu nhận các chùm sáng đơn sắc, so sánh cường độ bức xạ đi qua mẫu và đi qua dung môi rồi chuyển tính hiệu quang thành tính hiệu điện và tính toán dựa vào định luật Lambert-Beer. Bộ tự ghi đƣợc nối với máy tính và phần mềm chuyên dụng có khả năng tính toán, lưu trữ phổ, đối chiếu và so sánh khi cần thiết.

Phương pháp:

Xay nhuyễn, cân 20 g

Để lạnh đông (-15oC)

Ngâm trong dịch chiết

Lọc chân không lấy phần lỏng Ly tâm lấy

dịch trong

Quét phổ UV_Vis Nguyên liệu

thô

Hàm lượng anthocyanins được xác định bằng phương pháp pH vi sai. Mở máy quang phổ và làm nóng máy 30 phút trước khi đo. Chỉnh đường nền bằng nước cất ở bước sóng từ 400 đến 700nm. Dịch trích được pha loãng 5 lần với các dung đệm pH=1 và pH=4,5. Để mẫu đạt cân bằng trong 15 phút, quét phổ hấp thụ trong vùng khả kiến (vì phổ hấp thụ của anthocyanins nằm trong vùng thấy được từ 500 đến 550 nm). Bước sóng hấp thu cực đại được ghi nhận là bước sóng tại đó độ hấp thu A đo được là cao nhất. Rồi sau đó tiến hành đo độ hấp thu A tại 2 bước sóng vis max và 700 nm.

Hàm lƣợng anthocyanins đƣợc xác định theo công thức:

l

V K M a A







 

 (g) (1)

Trong đó: A là mật độ quang (độ hấp thu của anthocyanins) A=(Amax.pH=1- A=700nm.pH=1)-( Amax.pH=4,5- A=700nm.pH=4,5)

a: Lƣợng anthocyanins, g; M: Khối lƣợng phân tử của anthocyanins, g/mol; l:

chiều dài cuvet, cm; K: Độ pha loãng; V: Thể tích dịch chiết, l.

Ta tính đƣợc hàm lƣợng anthocyanins theo phần trăm:

%Anthocyanins toàn phần= 100%

10 ) 100

( w 2 m

a (2)

Trong đó: a là lƣợng anthocyanins tính đƣợc theo công thức (1) g; m: Khối lƣợng nguyên liệu ban đầu, g; w: Độ ẩm nguyên liệu, %.

 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa

Hoạt tính kháng oxy hóa được thực hiện bằng phương pháp DPPH.

Mẫu dịch chiết nếp than và đậu đen tách đƣợc ở dạng cao khô.

Hóa chất: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (Sigma, USA), vitamin C (Sigma, USA), methanol (Trung Quốc), dimethylsunphoxid (DMSO) 100%(Sigma, USA).

Chuẩn bị mẫu thí nghiệm:

Tạo dung dịch (dd) có các gốc tự do DPPH 6 Mm trong methanol.

Mẫu đo: cao khô đƣợc pha trong DMSO 100% với nồng độ 30 mg/ml.

Mẫu đối chứng: Vitamin C pha trong DMSO 100% với nồng độ 3 mg/ml.

Tiến hành thí nghiệm:

Mẫu đo: 100l dd mẫu đo+2800l MeOH+100l dd DPPH.

Mẫu đối chứng: 100l dd mẫu đối chứng+2800l MeOH+100l dd DPPH.

Mẫu blank (mẫu trắng): 100l dd DMSO 100% + 2800l MeOH + 100l dd DPPH.

Lắc và để phản ứng trong vòng 20-30 phút sau đó đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm

Tính kết quả

-Giá trị phần trăm ức chế: Q%=  

100 1

0





 







 

c c

A A

A A

Trong đó: A là độ hấp thu của dung dịch chứa mẫu thử A0 là độ hấp thu của DPPH khi không có mẫu Ac là độ hấp thu của dung dịch chứa chất đối chiếu

-Độ lệch chuẩn:  

i n

x xi



   2



Nếu giá trị phần trăm ức chế Q% > 50% thì mẫu đƣợc coi là biểu hiện hoạt tính ở nồng độ 1 mg/ml và sẽ đƣợc hạ nồng độ xuống 10 lần và tiếp tục đo nhƣ trên. Nếu ở nồng độ 0,1 mg/ml ta vẫn thu được Q% > 50 % mẫu sẽ tiến hành thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.

-Tìm giá trị ức chế IC50

Pha mẫu theo 6 thang nồng độ và tiến hành đo nhƣ trên. Tính giá trị IC50 bằng phần mềm GraphPad Prism thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế và nồng độ chất thử tính ra nồng độ của chất thử nghiệm mà ở đó 50% các gốc tự do đƣợc tạo bởi DPPH bị trung hòa do chất thử.

2.3.6 Phối chế sản phẩm cơ bản của nền Thixogel với tinh bột nếp than và gạo huyết rồng

Thixogel được hình thành theo một quy trình gồm hai bước. Một hỗn hợp bột sệt được tạo ra trong nước nóng chỉ chứa một ít chất hoạt động bề mặt và được đun nóng kết hợp với khuấy trộn liên tục đến khi bột tan ra hết. Sau đó hạ nhiệt độ đến 65oC và pha dầu sẽ đƣợc hòa trộn rồi tiếp tục khuấy.

 Công thức đề xuất:

Bảng 2.2: Công thức đề xuất phối chế Thixogel

Tướng Thành phần Chức năng Khối lượng

(%)

A Silicon acetate Màng bảo vệ da ƣa dầu 8.8

B

Nước cất Tướng nước 73

Tinh bột gạo Chất làm đặc, tạo gel, tạo màng 3.7

Bezalkonium chloride Chất nhũ hóa 1.0

Glycerol Chất làm ẩm 20.0

C Phenonip Chất bảo quản 0.5

 Sơ đồ phối chế

 Thuyết minh sơ đồ Sơ đồ 2.5: Quy trình phối chế nền Thixogel

t2 = 65oC Tướng B

Khuấy trộn

Hạ nhiệt độ

Tướng A

Khuấy

Khuấy tạo nhũ

Khuấy ổn định nhũ

Làm nguội

Sản phẩm Tướng C

t1 = 90oC T1 = 60 phút

t2= 65oC

tk= 65oC Tk = 70 phút

t3= 45oC T3 = 60 phút

Cân chính xác pha B gồm có: tinh bột gạo, Benzalkonium chloride, Glycerol, nước cất. Sau đó khuấy trộn kỹ pha B bằng máy khuấy cơ ở 90oC trong 60 phút, với tốc độ khuấy là 300 (vòng/phút). Sau khi khuấy đúng 60 phút thì hạ nhiệt độ pha B xuống 65oC.

Đồng thời cân chính xác pha A là : Silicon acetate. Dùng bể điều nhiệt để làm nhiệt độ pha A đến 65oC.

Sau khi nhiệt độ pha A và pha B bằng nhau, tiếp tục khuấy pha B bằng máy khuấy cơ và cho pha A từ từ vào và tiến hành khuấy tạo nhũ trong khoảng thời gian là 70 phút, với tốc độ khuấy 400 (vòng/ phút).

Sau thời gian khuấy tạo nhũ gel, hạ nhiệt độ nhũ gel xuống 45oC để ổn định nhũ.

Đồng thời cân pha C cho từ từ vào hỗn hợp nhũ gel. Khuấy ổn định trong 60 phút, với tốc độ khuấy 400 (vòng/ phút). Sau đó cho vào lọ, đậy nắp bảo quản.

Bảng 2.3: Điều kiện phối chế nền Thixogel

Giai đoạn khuấy Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút) Vận tốc (vòng/phút)

Tạo Gel 95 60 300

Tạo Thixogel 65 70 400

Ổn định 45 60 400

 Đánh giá sản phẩm nền của hệ Thixogel

Mẫu đối chứng là nền tinh bột bấp đƣợc khuấy trong cùng điều kiện.

 Kết quả đánh giá dựa trên thang điểm 5

Rất tốt ++ 5 điểm

Tốt + 4 điểm

Thỏa mãn 0 3 điểm

Kém - 2 điểm

Rất kém -- 1 điểm

Bảng 2.4: Chỉ tiêu đánh giá nền Thixogel

Chỉ tiêu Độ gây

mát Độ tan Độ gây nhớp

Độ bền SP

Tổng điểm

Phần trăm đạt Hệ số mi (%)

10 10 10 70 100

100

Mức phấn đấu + ++ + ++ 480 100

Mẫu đối chứng Sản phẩm

 Phương pháp thực hiện

Độ tan trên da (biểu thị cho độ phân tán của kem trên da): Thoa một lớp kem mỏng và đều trên bề mặt da. Sau đó đọc thời gian kem tan hết trên da bằng cách dùng tay thử và không cảm thấy nhờn dính vào da.

25s 35s 45s 55s

++ + 0 - --

Độ mát trên da: Khi thoa lên da sẽ cho cảm giác mát, dễ chịu. Và đƣợc cảm nhận thông qua người thử.

Không Có

- 0 +

Độ gây nhớt: Khi thoa lên da không có cảm giác nhớp khó chịu vì cảm giác dầu trên da. Được kiểm chứng thông qua người thử.

Không Có

- 0 +

Độ bền sản phẩm: sản phẩm đƣợc ly tâm ở 3000 vòng/phút với những khoảng thời gian khác nhau để xác định thời gian tách pha của sản phẩm.

10ph 20ph 30ph 40ph

-- - 0 + ++