CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu tiến cứu.
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
Số bệnh nhân tham gia vào nghiên cứu được tính theo công thức:
2 2
) 2 / 1
( ( )
) 1 (
p p Z p
n α ε
= − −
n = Số trường hợp cần nghiên cứu
Z(1-α/2) = 1,96 là hệ số tin cậy với độ tin cậy 95%
ε = 0,2 là sai số mong đợi tương đối.
P = 30% là tỷ lệ thai lâm sàng phác đồ ngắn/rFSH theo nghiên cứu của Kolibianakis [67].
Cỡ mẫu (n) = 225 bệnh nhân.
2.2.3. Nội dung và các biến số nghiên cứu 2.2.3.1. Các biến số về lâm sàng
- Thời gian vô sinh
- Nguyên nhân vô sinh
- Phân loại vô sinh: nguyên phát, thứ phát
- Số lần IVF
- Số nang thứ cấp (AFC)
- Liều FSH khởi đầu.
- Tổng liều FSH.
- Số ngày sử dụng FSH.
- Độ dầy của niêm mạc tử cung
- Số nang noãn >14 mm vào ngày tiêm hCG.
- Số noãn thu được.
- Số noãn thụ tinh
- Tỷ lệ thụ tinh
- Số phôi
- Đánh giá chất lượng phôi theo bốn độ: độ 1, độ 2, độ 3, độ 4
- Số phôi chuyển, số trường hợp chuyển phôi
- Số phôi đông lạnh, số trường hợp có phôi đông lạnh
- Tỷ lệ thai lâm sàng
2.2.3.2. Các biến số về cận lâm sàng
Các xét nghiệm nội tiết cơ bản vào ngày thứ 2 của chu kỳ kinh bao gồm FSH, AMH
2.2.4. Các phương tiện và vật liệu nghiên cứu
• Máy siêu âm đầu dò âm đạo tần số 7,5 MHz. Hãng ALOCA SSD 1400 (Nhật Bản).
• Máy AXSIM ABBOTT (Mỹ) định lượng các hormon nội tiết bằng kỹ thuật E.I.A (Enzym Immuno Assay): FSH (IU/l), LH (IU/l), Estradiol (pg/ml), Progesteron (nmol/l), định lượng β HCG (IU/l).
• Tủ nuôi cấy phôi ở nhiệt độ 370C và 5% CO2 : Themoforma (Mỹ)
• Kính hiển vi soi nổi Olympus (Nhật): quan sát và nhặt noãn, đánh giá tinh dịch đồ.
• Kính hiển vi đảo ngược và bộ vi thao tác của hãng Olympus (Nhật):
thực hiện ICSI, quan sát noãn thụ tinh, đánh giá chất lượng phôi.
• Môi trường sử dụng để thao tác với noãn: ASPTM của hãng Vitrolife (Thụy Điển)
• Môi trường để lọc rửa tinh trùng: SpermgradTM, SpermrinseTM của hãng Vitrolife (Thụy Điển)
• Môi trường để thực hiện ICSI: HyaseTM-10X, GameteTM của hãng Vitrolife (Thụy Điển)
• Môi trường để nuôi cấy phôi và chuyển phôi: IVFTM hãng Vitrolife (Thụy Điển)
• Môi trường để đông lạnh phôi: FreezeKit 1 hãng Vitrolife (Thụy Điển)
• Kim hút noãn dài 30 cm số 17 của hãng Laboratoire C.C.D (Pháp) Catheter long Frydman set để chuyển phôi của hãng Laboratoire C.C.D (Pháp).
2.2.5. Các bước tiến hành nghiên cứu 2.2.5.1. Khám lâm sàng và xét nghiệm
Trước khi bắt đầu thực hiện các quy trình thụ tinh trong ống nghiệm, mỗi cặp vợ chồng đều được khám lâm sàng và làm các xét nghiệm cơ bản
• Đối với người vợ:
Khám phụ khoa tổng quát.
Xét nghiệm: HbsAg. TPHA, HIV, Chlamydia, công thức máu, sinh
hóa máu, xét nghiệm nội tiết cơ bản FSH, E2, LH vào ngày 3 của chu kỳ kinh.
Siêu âm tử cung và hai buồng trứng.
• Đối với người chồng:
Khám nam khoa tổng quát.
Xét nghiệm: HbsAg, TPHA, HIV và tinh dịch đồ.
2.2.5.2. Các bước thực hiện nghiên cứu
Sau khi hoàn thành hồ sơ điều trị vô sinh, các đối tượng nghiên cứu đủ điều kiện về tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ sẽ được thực hiện theo các bước sau đây:
1. Đối tượng nghiên cứu thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm bằng phác đồ ngắn.
2. Theo dõi sự phát triển của nang noãn bằng siêu âm và các xét nghiệm nội tiết.
3. Gây trưởng thành noãn bằng hCG
4. Chọc hút noãn.
5. Thực hiện kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn (ICSI).
6. Chuyển phôi vào buồng tử cung
7. Hỗ trợ pha hoàng thể.
8. Thử β hCG để xác định có thai và siêu âm theo dõi sự phát triển của thai.
9. Đánh giá kết quả của phác đồ ngắn bao gồm: đáp ứng của buông trứng, số nang noãn, số noãn, số phôi, tỷ lệ thai sinh hóa và tỷ lệ thai lâm sàng.
Sử dụng hCG (n = 252)
Chọc hút noãn & lọc rửa tinh trùng
ICSI (n = 251)
Chuyển phôi tươi (n = 209)
Hỗ trợ pha hoàng thể
Thử β hCG. Siêu âm thai
Theo dõi sự phát triển của nang noãn bằng siêu âm Kích thích buồng trứng bằng phác đồ ngắn (n = 252)
Đánh giá kết quả của phác đồ
Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu 2.2.6. Các tiêu chuẩn sử dụng trong nghiên cứu
- Phân nhóm AMH về tiên lượng đáp ứng buồng trứng theo Trung tâm hỗ trợ sinh sản Quốc gia: ≥ 1,52 ng/ml tiên lượng đáp ứng buồng trứng kém,
Loại trừ
Không có noãn (n=1)
Không có phôi chuyển (n=1)
Đông phôi toàn bộ (n = 41)
từ 1,52-4,04 ng/ml tiên lượng đáp ứng buồng trứng bình thường và > 4,04 ng/l là tiên lượng đáp ứng buồng trứng quá mức [10].
- Thai sinh hóa là các trường hợp xét nghiệm beta hCG >5 UI/l sau 14 ngày chuyển phôi nhưng không có túi thai trong buồng tử cung.
- Thai lâm sàng là các trường hợp quan sát được túi thai hoặc âm vang thai trên siêu âm, kể cả trường hợp thai ngoài tử cung.
- Chất lượng noãn được đánh giá theo tiêu chuẩn của Trung tâm hỗ trợ sinh sản Quốc gia: noãn MII là noãn hình cầu, bào tương đồng nhất, sáng màu, không có dấu hiệu bất thường. Noãn thụ tinh là noãn hình cầu có hai thể cực, hai tiền nhân có màng riêng, kích thước bằng nhau, nằm cạnh nhau ở trung tâm noãn.
- Theo tiêu chuẩn đang được áp dụng tại trung tâm hỗ trợ sinh sản bệnh viện phụ sản trung ương.
- Noãn trưởng thành (noãn MII):
Nhìn đại thể (sau lấy noãn - trước tách noãn): Nhiều lớp tế bào hạt tỏa rộng hình vòng tia (4 - 9 lớp hoặc hơn) tế bào hạt màu vàng nhạt. Sau khi tách noãn khỏi tế bào hạt: Bào tương đồng đều, chiết quang sáng, nhìn thấy cực cầu 1.
- Noãn chưa trưởng thành MI
Nhìn đại thể: các lớp tế bào hạt không tỏa rộng, ít lớp bào tương. Tách noãn: không có cực cầu 1, không có nang mầm
- Noãn chưa trưởng thành GV
Nhìn đại thể: Các lớp tế bào hạt co chặt lại bao quanh noãn thường có màu tối, có thể nhìn thấy bào tương noãn hơi tối và nang mầm (GV) ở trong. Tách noãn: Không có cực cầu 1 nhìn thấy rõ GV và 1 hạt nhân cực lớn trong GV.
- Noãn thoái hóa:
Nhìn đại thể: ít tế bào hạt, các tế bào hạt màu sáng trắng hơn, thường rời rạc không bám vào noãn, có dạng như gelatin (nhầy sáng), bào tương nhợt nhạt.
Tách noãn: Bào tương nhợt nhạt, có thể có điểm thoái hóa bên trong bào tương.
Tỷ lệ noãn MII = số noãn MII/tổng số noãn.
Đánh giá về sự thụ tinh :
18 - 20 giờ sau khi cho tinh trùng thụ tinh với noãn, noãn đã thụ tinh là khi có 2 tiền nhân quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược. Đánh giá số noãn đã thụ tinh và số noãn không thụ tinh.
Xác định tỷ lệ thụ tinh = số noãn thụ tinh/ tổng số noãn.
Đánh giá về chất lượng phôi: Dựa vào tỷ lệ các mảnh vỡ bào tương (fragments) tốc độ phân chia của phôi và độ đồng đều của các tế bào:
- Phôi độ 4 (phôi có chất lượng rất tốt – top quality embryo - TQE): có 4 - 5 tế bào vào ngày thứ 2 hoặc có 7-8 tế bào vào ngày thứ 3, các tế bào đồng đều, không có mảnh vỡ (fragments).
- Phôi độ 3 (phôi có chất lượng tốt): có 4 - 5 tế bào vào ngày thứ 2 hoặc 7 - 8 tế bào vào ngày thứ 3, các tế bào đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ < 10%.
- Phôi độ 2: có 3 - 4 tế bào vào ngày thứ 2 hoặc 6 - 8 tế bào vào ngày thứ 3, các tế bào không đồng đều hoặc tỷ lệ mảnh lớn hơn 10% và ít hơn 25%.
- Phôi độ 1: có 2 tế bào vào ngày thư 2 hoặc có ≤ 5 tế bào vào ngày thứ 3 hoặc tỷ lệ mảnh vỡ trên 25%.
∗ Trong nghiên cứu này chúng tôi quy định phôi tốt là phôi độ 4 và phôi độ 3, phôi trung bình là phôi độ 2, phôi xấu là phôi độ 1.