4. Chuyển gen ở thực vật
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn
Phương pháp nuôi cấy: Chủng khuẩn giữ trong glycerol được lấy ra cấy lỏng trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp. Nuôi lắc 200vòng/phút ở 37oC qua đêm. Sau đó cấy ria trên đĩa petri chứa LB đặc có chứa kháng sinh, nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Giữ chủng: Bổ sung glycerol vô trùng đến nồng độ cuối cùng là 30% vào 0,5 - 1ml dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua đêm, trộn đều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và giữ chủng ở điều kiện -20oC.
2.3.2. Phương pháp tách ARN
Mẫu được nghiền trong dung dịch Nito lỏng, sau đó được bổ sung tác nhân gây biến tính protein mạnh và hiệu quả là 2-mercaptoethanol. Chất này có tác dụng ức chế hoạt động của các RNase nội bào và tách các protein liên kết ra khỏi RNA.
Loại bỏ các protein ra khỏi mẫu bằng cách xử lý phenol-chloroform-isoamyl alcohol rồi li tâm, để kết tủa protein và cặn bã còn nucleic axit sẽ hòa tan ở phần trên. Kết tủa nucleic axit bằng cách thêm lượng ethanol dư thừa. Tránh sự phân hủy RNA bằng cách dùng 3M LiCl và DEPC – H2O. Vì phương pháp sử dụng Trizol không thu được ARN đối với cây dương xỉ vì vậy phương pháp thủ công bắt buộc phải sử dụng trong công đoạn này.
Quy trình:
Nghiền 100mg lá trong Nito lỏng bằng cối sứ để phá vỡ vách tế bào. Bột đã nghiền cho vào ống ly tâm 1,5ml.
Bổ sung 500 àl Extraction Buffer, 100 àl 2-mercapethanol và 500 àl phenol- chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1)
Voltex 5 phút, ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 10 phút
Thu dịch nổi sang ống mới. Bổ sung lượng phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) với tỉ lệ 1:1. Lắc ống nhẹ nhàng trong 5 phút. Sau đó ly tâm 8.000 vòng/ phút trong 10 phút.
Chuyển lớp trên sang ống eppendorf 1.5 ml rồi bổ sung isopropanol với tỉ lệ 1:1, 25 àl NaCl 5M, sau đú lắc nhẹ nhàng.
Bổ sung 900 àl DEPC – H2O và 200 àl LiCl 3M
Ủ 30 phút ở -20oC, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu phần tủa Bổ sung 500 àl Ethanol 70%. Voltex nhẹ
Thu phần tủa. Bổ sung 200 àl DEPC – H2O và 200 àl LiCl 3M, 20 àl 3M Sodium acetate, 500 àl Ethanol 100%. Voltex nhẹ
Ủ 30 phút ở -20 oC, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa Bổ sung 500 àl Ethanol 70%. Voltex. Ly tõm 10.000 vũng/ phỳt trong 15 phỳt ở 4oC, thu tủa
Bổ sung 30 àl DEPC – H2O. Ủ 55-60oC trong 5 phỳt để RNA tan hoàn toàn.
2.3.3. Phương pháp tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA theo bộ kit Two-step RT PCR Kit của Affymetrix – Mỹ Bảng 2.2. Phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần Thể tích
RNA khuụn 10àl
Reverse Primer ( Stocks: gene specific primer 10 àM, oligo dT 25 àM)
1 àl
Nước (Rnase – Free) 9 àl
Mix nhẹ, ủ trong 5 phút ở 75oC
RT Buffer 5X 5 àl
Rnase Inhibitor (4units/ àl) 1 àl
PCR Nucleotide Mix (10mM) 1.25 àl
M-MLV RT (25X) 1 àl
Nước (Rnase – Free) 6.75 àl
Ủ 42oC trong 30 phút, 95oC trong 5 phút. Giữ ở 4oC
Sản phẩm của phản ứng Reverse Transcriptase được tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC theo thành phần và chu trình Phụ lục 4.
2.3.4. Phương pháp xử lý với enzym giới hạn
Đoạn ADN và vector được xử lý với cùng enzym giới hạn để tạo đầu cắt tương ứng. Để hiệu suất phản ứng cao cần tinh sạch DNA và plasmid trước khi tiến hành. Phản ứng cắt được thực hiện theo các thành phần như sau:
Bảng 2.3. Phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn
Thành phần Thể tớch (àl )
+ Với một enzym
H2O 5.8
Đệm 10X riêng của enzyme 1.0
DNA/plasmid 3.0
Enzym (10 U/l) 0.2
Tổng thể tích phản ứng 10.0
+ Với hai enzym
H2O 5.7
Đệm 10X chung tối ưu cho hai enzyme 1.0
DNA/plasmid 3.0
Enzym (10 U/l) 0.1
Enzym (10 U/l) 0.2
Tổng thể tích phản ứng 10.0
Phản ứng được ủ ở 37oC trong 2-5 giờ. Sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
+ Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector
Đoạn DNA cần nối ghép và vector đã được mở vòng được trộn lẫn với nhau theo tỷ lệ 3 : 1. Bổ sung enzym T4 ligase vào hỗn hợp. Hỗn hợp phản ứng được trộn theo tỉ lệ Bảng 2.6.
Bảng 2.4. Phản ứng ghép nối đoạn gen vào vector
Thành phần Thể tớch (àl )
H2O 4.5
Đệm T4 ligase 10X 1.0
Đoạn gen cần gắn 3.0
Vector đã mở vòng 1.0
T4 ligase 0.5
Tổng thể tích phản ứng 10.0 Phản ứng được ủ qua đêm ở 16oC.
2.3.5. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α được tiến hành bằng phương pháp sốc nhiệt theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn dưới tác dụng của hoá chất hoặc điện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN có thể chui vào.
Tạo tế bào E.coli khả biến sử dụng CaCl2
Lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa khuẩn nuôi lắc trong môi trường LB ở 37oC qua đêm.
Hút 1ml dịch khuẩn rồi cấy chuyển vào bình chứa 100ml môi trường LB lắc ở 37oC
fancol 50ml đã khử trùng, làm lạnh vi khuẩn xuống 0oC bằng cách cắm đá trong 10 phút, sau đó chia ra các ống eppendorf. Thu tế bào bằng ly tâm 6.000 vòng/phút, 5 phút. Hòa tan vào CaCl2- MgCl2 (CaCl2 20mM- MgCl2 80mM). Ly tâm 6.000 vũng/phỳt trong vũng 5 phỳt. Loại dịch thu tế bào. Hũa tan tế bào trong 50àl CaCl2 0,1M
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli
Trộn 5àl sản phẩm (DNA,plasmid) + 50àl TBKB. Đặt trờn đỏ 30 phỳt. Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút. Cắm đá 2- 5phút . Bổ sung LB lỏng rồi lắc 37oC, 1giờ.
Trải lên đĩa chứa môi trường kháng sinh chọn lọc thích hợp + X-gal 40mM (nếu có) và nuôi ở 37oC
2.3.6. Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmid của vi khuẩn E.coli Hoá chất sử dụng
Dung dịch I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8 Dung dịch II: 0,2 N NaOH, 1% SDS
Dung dịch III: 60 ml kali acetate 5M, 28,5 ml H2O
Dung môi loại protein: Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1), chloroform : isoamyl alchohol (24:1), TE 0,01M pH 8,0
Quy trình
Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc, lắc qua đêm ở 37oC, 200 vòng/phút. Chuyển 1,5 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf và đem ly tâm 8.000 vòng/phút, 5phút, 4oC để thu tế bào. Tủa thu được hoà trong 100 àl dung dịch sol I. Bổ sung ngay 200 àl dung dịch II, đảo nhẹ nhàng.
Sau đú bổ sung tiếp 150 àl dung dịch III. Thờm 550 àl dung dịch chloroform : isoamyl alchohol ( 24 : 1), đảo nhẹ nhàng. Ly tâm 12.000 vòng/phút, 4oC, 15 phút.
Chuyển dịch nổi sang ống Eppendorf mới và tủa bằng isopropanol. Để lạnh -20oC trong 20 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút để thu plasmid. Rửa cặn bằng 0,5 ml cồn 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, làm khô và hoà cặn trong 30 àl nước đề ion, giữ ở -20oC. Bổ sung RNase nồng độ 100 àg/ml vào mẫu. Ủ mẫu ở 37oC trong 2 giờ. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra DNA.
Tinh sạch DNA
Tinh sạch đoạn gel bằng kít tinh sạch của Thermoscientific
Điện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy đoạn gel chứa đoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf. Bổ sung dịch gắn kết DNA (Gel Binding) vào ống chứa mảnh gel, Với phương pháp thôi gel: tỉ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5, đối với phương pháp tinh sạch Vmẫu : VGB = 1 : 1. Ủ hỗn hợp ở 60oC trong 10 phút và cứ 2 - 3 phút đảo nhẹ một lần cho đến khi gel tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA (Binding column) và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phỳt. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 400 àl đệm rửa Washing Buffer lờn cột liờn kết DNA. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Có thể ly tâm 2 lần để loại bỏ hoàn toàn đệm rửa Washing Buffer. Để khô 5 phút bay cồn. Chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5 ml mới. Bổ sung 30-50 àl dung dịch hũa tan DNA (Elution Buffer) (hoặc nước khử ion đã khử trùng) vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA. Bỏ cột và bảo quản DNA vừa tinh sạch ở -20oC.
2.3.7. Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng xung điện
Chuẩn bị vi khuẩn A.tumefaciens khả biến
Nuôi phục hồi và thu tế bào vi khuẩn ở pha tế bào phát triển mạnh bằng cách hút 1 ml vi khuẩn A.tumefaciens C58 (Nuôi lắc qua đêm ở 28o C) +10ml LB có bổ sung khỏng sinh rifamycin (50àg/ml) nuụi lắc ở 28o C trong 3-4 giờ. Cắm đỏ 20-30 phút rồi chia ra các ống eppendorf 1,5ml. Ly tâm 6.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu tủa và rửa bằng buffer HEPES 1mM 2 lần. Rửa lại bằng glyxerol lạnh 10%, ly tâm 6000 vòng/phút, 15 phút, 4oC, thu cặn. Hòa tan cặn trong glyxerol 10%
Biến nạp vào Agrobacterium bằng xung điện
Trộn 1àl plasmid tinh sạch với 50 àl tế bào A.tumefaciens C58 khả biến.
Chuyển toàn bộ vào cuvette, để lạnh ở -20oC trong 20 phút. Biến nạp ở hiệu điện thế 2.2 kV. Nuôi phục hồi trong môi trường LB lỏng (1ml) ở 28o C trong khoảng 2- 3 giờ. Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp với rifamycin (50 àg/ml) và kanamycin (50àg/ml))
2.3.8. Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A. tumefaciens (theo Topping, 1998 )
Dòng khuẩn lạc A.tumefaciens được kiểm tra là mang plasmid tái tổ hợp được bảo quản trong glyxerol ở -20oC sẽ được nuôi cấy trên môi trưởng LB đặc có chứa kháng sinh chọn lọc kana 50mg/l + rifa 50mg/l nuôi tối ở 28oC. Chọn một khuẩn lạc tròn đều, đứng độc lập nuôi trong 10ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc qua đêm (khoảng 16 giờ) ở 28oC, lắc 250 vòng/phút. Sau đó nuôi phục hồi dịch khuẩn trên trong LB lỏng với tỉ lệ 1:10 trong khoảng 4 giờ phục vụ cho biến nạp.
Giữ lạnh khuẩn trên đá. Đo OD550 = 0.6-0.8. Sau đó li tâm lạnh ở nhiệt độ 4oC hòa tan tủa trong mụi trường ẵ MS để tạo dịch huyền phự vi khuẩn dựng cho biến nạp vào các mảnh thuốc lá.
Lây nhiễm
Mảnh lá được ngâm với dịch huyền phù vi khuẩn để tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào mô lá. Sau 30 phút lây nhiễm, chuyển các mảnh lá lên giấy thấm đã khử trùng, thấm khô và cấy lên môi trường tạo đa chồi GM không có kháng sinh chọn lọc để tạo điều kiện cho mô lá và vi khuẩn phát triển đồng thời, nuôi trong điều kiện tối.
Chọn lọc mảnh lá và tái sinh đa chồi sau chuyển gen
Sau 2 ngày đồng nuôi cấy các mảnh lá được chuyển sang môi trường chọn lọc chồi GM có bổ sung kháng sinh cefotaxim 500mg/l và hygromycin 5mg/l (Phụ lục 7) để loại bỏ các vi khuẩn còn ở bên ngoài mô lá không xâm nhập được và chọn lọc những mảnh lá có mang vi khuẩn chuyển gen. Sau 2-3 tuần, các mảnh lá bắt đầu được cảm ứng tạo mô sẹo được tách ra và cấy chuyển sang môi trường chọn lọc chồi 1. Từ những cụm chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc, chọn những cụm chồi phân hoá mạnh, tách các cụm chồi có kích thước khoảng 0,5 - 1cm2 để tiếp tục chọn lọc chồi tái sinh. Đến khi các chồi thật phát triển từ các cụm chồi thì tiến hành tách từng chồi riêng rẽ và cấy lên môi trường chọn lọc chồi 2 có bổ sung hygromycin với nồng độ cao hơn (10mg/l) để tăng áp lực chọn lọc (Phụ lục 7).
Tái sinh cây hoàn chỉnh
Từ những cụm chồi phân hoá mạnh, chọn tách những chồi độc lập, có 2 - 3 lá phân hoá rõ ràng, dài từ 2 - 3 cm cấy sang môi trường ra rễ chọn lọc (môi trường RM có bổ sung hygromycin 10mg/l, cefotaxime 500mg/l) để tạo cây hoàn chỉnh.
Thí nghiệm được đặt trong điều kiện ánh sáng điện 2000 Lux, 16 giờ sáng/8 giờ tối, nhiệt độ trong phòng duy trì ở mức 260C.
Ra cây trên giá thể trấu cát
Từ những dòng trên môi trường ra rễ chọn lọc những dòng sinh trưởng phát triển mạnh, cao 5 - 7 cm để ra cây vào giá thể trấu : cát (tỉ lệ 1:1). Sau 14 ngày chuyển các dòng vào chậu đất trong nhà lưới.
Sau khi trồng vào bầu đất, cây hồi phục và ra lá mới thì tiến hành lấy mẫu lá để phân tích cây chuyển gen.
2.3.9. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thuốc lá
Phương pháp tách DNA tổng số (Phương pháp CTAB) (Cetyl threemethyl Amomnium Bromide do Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991, có cải tiến)
Mẫu được nghiền trong nito lỏng, thu lấy bột rồi cho vào ống eppendorf.
Thêm 0.75ml đệm CTAB đã làm ấm ở 65oC trong 10 phút. Ủ trong bể ổn nhiệt 65oC trong 2 giờ, lắc nhẹ nhàng 15 phút/ lần. Sau đó chuyển hỗn hợp ra để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Thêm 0,75ml dung dịch Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 lắc nhẹ trong 10 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 10 phút. Tủa DNA bằngisopropanol tỉ lệ 1: 1, xoay nhẹ nhàng vài phút rồi giữ ở -20oC trong 1h. Ly tâm 10.000 vòng/ phút, 10 phút, bỏ dịch trên thu tủa. Hòa tan tủa trong 0.5ml TE pH: 8 để ở tủ 4oC qua đêm.
Thờm 15 àl Rnase, ủ ở 37oC trong 90-120 phỳt để loại bỏ hoàn toàn Rnase.
Thêm dung dịch phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, lắc nhẹ trong 15 phút, ly tâm 10000 vòng/phút, 10 phút. Hút dịch sang ống effendorf mới sau đó thêm Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1 tỷ lệ 1: 1, lắc nhẹ trong 15 phút. Và ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút. Hút dịch nổi sang ống eppendorf mới và tủa trong isopropanol tỉ lệ 1:1, để hỗn hợp ở -20oC trong 1h. Ly tâm 10.000 vòng/phút , 7 phút. Loại bỏ dịch nổi phía trên, thu tủa và rửa bằng cồn 70% lạnh. Thổi khô trong 20 phút ở trong box. Hòa tan tủa bằng TE và giữ trong tủ 4oC.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU