CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.4. Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen arsC
Sau khi tham khảo các công trình để tìm hiểu sự ảnh hưởng của vật liệu biến nạp (cuống hay mảnh lá), kích thước mảnh lá, tuổi cây thuốc lá, mật độ tế bào vi khuẩn đến hiệu quả chuyển gen, chúng tôi tiến hành biến nạp chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58 đã mang vector chuyển gen pCambia1301- arsC vào mảnh lá cây thuốc lá. Trong quá trình chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens, đoạn gen ngoại lai sẽ sát nhập vào một ví trí bất kỳ trong genome của cây trồng. Ở mỗi vị trí khác nhau thì hiệu quả mà gen được đưa vào sẽ có biểu hiện khác nhau.
Giai đoạn tái sinh chồi
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens theo phương pháp Topping (1998) có cải tiến với 3 lần bố trí thí nghiệm. Kết quả theo dõi quá trình tái sinh của các dòng thuốc lá qua các lần thí nghiệm và các giai đoạn chọn lọc khác nhau được thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1: Tỉ lệ tái sinh của các mẫu qua các giai đoạn Đối tượng
nghiên cứu
Lần chuyển
gen
Chọn lọc mảnh lá
Chọn lọc cụm chồi
Chọn lọc ra rễ (lần 1)
Chọn lọc ra rễ (lần 2)
Chọn lọc ra rễ (lần 3)
Mảnh lá được biến nạp Agrobacterum
C58 mang pCambia1301-
arsC
1 55/60
(91,67%)
85/105 (80,95%)
48/85 (56,47%)
30/48 (62,50%)
22/30 (73,33%)
2 53/58
(91,38%)
79/95 (83,16%)
32/79 (40,51%)
21/32 (65,62%)
15/21 (71,43%)
3 61/65
(93,85%)
82/97 (84,54%)
49/82 (59,76%)
31/49 (63,27%)
25/31 (80,65%)
TB 92,3% 82,88% 52,25% 63,80% 75,14%
ĐC (+)
1 20/20
(100%)
32/35 (91,43%)
10/10
(100%) - -
2 12/12
(100%)
29/29 (100%)
10/10
(100%) - -
3 15/15
(100%)
31/31 (100%)
10/10
(100%) - -
TB 100% 97,14% 100% - -
ĐC (-)
1 0/15
(0%) - - -
-
2 0/15
(0%) - - - -
3 0/15
(0%) - - - -
TB 0% - - - -
ĐC (+): Mẫu không chuyển gen trên môi trường không bổ sung kháng sinh.
ĐC (-) : Mẫu không chuyển gen trên môi trường có bổ sung kháng sinh
Cấu trúc gen chuyển pCambia1301- arsC được chuyển đồng thời với gen kháng hygromycin có khả năng tạo ra sản phẩm ức chế tác động của hygromycin được bổ sung trong môi trường chọn lọc. Do đó trong môi trường GM hygromycin 5 mg/l hoặc 10 mg/l, những mảnh lá, cụm chồi, cây không mang cấu trúc gen chuyển pCambia1301- arsC đồng thời không mang gen kháng hygromycin thì sẽ không thể tái sinh và phát triển được. Hygromycin gây ức chế quá trình sinh tổng hợp protein và các con đường sinh tổng hợp khác liên quan, trong đó có hoạt động
của lục lạp. Mảnh lá, cụm chồi, cây bị mất khả năng hấp thụ dinh dưỡng, hoạt động của lục lạp bị rối loạn dẫn đến vàng và chết dần.
Giai đoạn chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen
Theo kết quả tỉ lệ tái sinh của các mẫu (Bảng 3.1), các mảnh thuốc lá sau chuyển gen tái sinh đa chồi trên môi trường chọn lọc hygromycin 5mg/l là khá cao (92,3%/) so với đối chứng trên môi trường không bổ sung kháng sinh (100%).
Trong khi đó các mảnh lá đối chứng không chuyển gen không sống sót được trên môi trường chọn lọc, vàng và chết dần.
A B C
Hình 3.16. Hình ảnh chọn lọc mảnh lá tái sinh đa chồi sau chuyển gen
(A): Mảnh lá đối chứng trên môi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (B): Mảnh lá đối chứng trên môi trường không bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l, (C): Mảnh lá mang cấu trúc gen chuyển arsC trên môi trường đa chồi có bổ sung kháng sinh chọn lọc hygromycin 5mg/l và kháng sinh cefotaxime 500mg/l.
Giai đoạn chọn lọc cụm chồi sau chuyển gen
Những cụm chồi từ mảnh lá tái sinh đa chồi tốt được chuyển sang môi trường chọn lọc GM hygromycin 10mg/l để tăng áp lực chọn lọc, sàng lọc các cụm chồi đã có gen kháng hygromycin chuyển vào nhưng không hoạt động phiên mã, dịch mã (Hình 3.17).
Hình 3.17. Hình ảnh chồi thuốc lá trong môi trường đa chồi bổ sung
Trong môi trường tái sinh đa chồi tăng nồng độ kháng sinh hygromycin lên 10mg/l, những chồi thuốc lá không có gen chuyển vào sẽ vàng dần, không phát triển và chết. Các chồi mang gen chuyển thành công sẽ phát triển xanh tốt.
Giai đoạn chọn lọc cây tái sinh hoàn chỉnh
Dòng mang cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh phải có khả năng ra rễ trên môi trường chọn lọc để tạo thành cây hoàn chỉnh trong khi những chồi không chuyển gen sẽ không có khả năng ra rễ. Những chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường chọn lọc ra rễ (RM + hygromycin 10mg/l). Đối với thuốc lá, chồi cũng có thể ra rễ ngay trên môi trường MS nhưng tỉ lệ ra rễ ít hơn nhiều so với môi trường RM có bổ sung IBA 0,1 mg/l. Tỉ lệ ra rễ của chồi qua 3 lần chọn lọc trên môi trường RM hygromycin 10mg/l là khá cao (tỉ lệ chọn lọc lần 3 trung bình qua 3 đợt thí nghiệm là 75,14%).
A B C
Hình 3.18. Khả năng ra rễ của các chồi trên môi trường RM hygromycin 10mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, (A):Cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l. (B): Rễ cây thuốc lá chuyển gen tái sinh hoàn chỉnh trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l, (C): Cây đối chứng và cây chuyển gen cấy trên môi trường ra rễ có kháng sinh hygromycin 10 mg/l + cefotaxime 500 mg/l.
Như vậy có thể kết luận đã hoàn thành việc chuyển gen và chọn lọc cây in vitro sau chuyển gen. Qua các giai đoạn chọn lọc từ 183 mảnh lá trong 3 lô thí nghiệm thu được 28 dòng chuyển gen phát triển tốt, lá xanh đậm, chồi mập, rễ dài.
Những dòng này sẽ được ra cây trong môi trường tự nhiên.
Giai đoạn ra cây vào giá thể đất: trấu : cát
Chọn mỗi dòng 3 cây sinh trưởng và phát triển tốt trong in vitro sau 1 tháng nuôi cấy được rửa rễ và đưa trồng trong nhà lưới trên giá thể trấu: đất: cát (tỷ lệ 1:1:1). Để cây thích nghi dần với môi trường đất và tránh mất nước đột ngột dẫn đến cây chết, sau khi đã ra cây vào bầu đất, cho vào túi ni lông sạch, ghim giữ ở phần trên túi và cho lại vào phòng nuôi cây điều khiển nhiệt độ 25-28o C, cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày để cây phát triển ổn định. Sau 7 ngày đưa cây ra nhà lưới để cây thích nghi với điều kiện ánh sáng tự nhiên. Trong tổng số 28 dòng có 20 dòng cây thuốc lá phát triển tốt. Với đặc điểm là hệ rễ phụ của cây thuốc lá phát triển mạnh, có thể phát triển những đốt thân gần gốc nên tỷ lệ sống của các dòng khi vào giá thể khá cao (>71%), chứng tỏ cây thích nghi với điều kiện ngoại cảnh khá tốt (Hình 3.19).
Hình 3.19. Cây thuốc lá hoàn chỉnh được trồng trong bầu đất: trấu: cát Như vậy, việc chuyển gen arsC vào cây thuốc lá, chọn lọc sau chuyển gen, tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường chọn lọc và trồng cây vào bầu đất đã đạt được kết quả bước đầu. Các dòng thuốc lá chuyển gen đã sẵn sàng cho việc đánh giá tiếp theo.