CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen arsC
Vector biểu hiện pCambia 1301 có chứa promoter CaMV 35S là một promoter mạnh dùng để biểu hiện trong tế bào thực vật. Do vậy chúng tôi chọn promotor CaMV 35S để điều khiển gen arsC phục vụ cho quá trình chuyển gen vào cây thuốc lá (Hình 3.9).
Hình 3.9. Sơ đồ cấu trúc vector pCambia 1301-arsC
Vector pCambia1301 và pBT- arsC đều chứa điểm cắt của enzyme cắt giới hạn Eco72I và NcoI. Thực hiện đồng thời phản ứng cắt pCambia1301 và pBT-arsC với hai enzyme giới hạn trên. pCambia 1301 sau khi cắt với enzyme Eco72I và NcoI sẽ loại bỏ gen GUS, còn pBT-arsC sẽ cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT và gen arsC. Một enzyme có đầu bằng còn một enzyme có so le, như vậy đoạn gen sẽ được gắn thuận chiều với promoter trên vector tái tổ hợp. Kết quả sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.10.
Hình 3.10. Sản phẩm cắt plasmid pCambia1301 và pBT-arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1: pCAMBIA1301 được cắt bởi NcoI và Eco72I, 2: pBT-arsC được cắt bởi NcoI và Eco72I
Điện di sản phẩm cắt cho thấy plasmid pCambia1301 có kích thước khoảng 11,8 kb. Plasmid này đã được cắt bằng hai enzyme NcoI và Eco72I cho 2 vạch (giếng 1), 1 vạch khoảng 9,8 kb là của vector pCambia 1301 có chứa promoter CaMV 35S, gen kháng kháng sinh hygromycin và vạch còn lại cho kích thước khoảng 2 kb tương ứng với đoạn gen GUS; PBT- arsC sau khi cắt cho 2 vạch băng, 1 vạch khoảng 2.7kb là vector pBT và 1 vạch khoảng gần 500 bp là gen arsC (giếng 2).
Gen arsC và vector pCambia1301 sau khi cắt được tiến hành tinh sạch nhằm thu lại gen mục tiêu đồng thời loại bỏ các tạp chất để cho quá trình thiết kế vector có hiệu quả cao. Khi dung dịch qua cột tinh sạch, DNA sẽ được gắn vào các phân tử có ái lực cao với chúng cố định trên màng lọc của cột. Dịch đệm cùng agarose
được loại bỏ nhờ ly tâm với tốc độ cao. DNA được thu lại bằng nước khử ion.
Sản phẩm tinh sạch được kiểm tra trên gel agarose 1 % thể hiện trên hình 3.11
Hình 3.11. Sản phẩm tinh sạch pCambia1301 và gen arsC sau khi cắt bằng enzyme NcoI và Eco72I, M: Marker 1 kb, 1: Phân mảnh của pCambia1301 cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch), 2: gen arsC được cắt bằng NcoI và Eco72I (sau tinh sạch)
Kết quả sản phẩm tinh sạch (Hình 3.11) có hàm lượng cao, không bị đứt gẫy, đúng với kích thước như tính toán lý thuyết của gen arsC và vector pCambia1301 đã loại bỏ gen GUS. Chứng tỏ quá trình tinh sạch đủ điều kiện để thực hiện phản ứng lai nhờ T4 ligase tạo vector tái tổ hợp pCambia 1301-arsC.
Thực hiện phản ứng ligate đoạn gen arsC vào vector pCambia1301 (ligate qua đêm ở 22oC), sau đó biến nạp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt và trải trên môi trường chứa chất kháng sinh kanamycin 50mg/l, nuôi ở 37oC để kiểm tra các khuẩn lạc mang cấu trúc biến nạp.
3.2.2. Kết quả kiểm tra vector pCambia 1301- arsC Kiểm tra vector pCambia 1301- arsC bằng PCR
Các khuẩn lạc mọc trên môi trường chứa kháng sinh kanamycin 50mg/l. Do vậy theo lý thuyết thì các chủng khuẩn này phải mang vector pCambia1301 chứa gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng có thể mang các vector tự đóng vòng hoặc các gen đích bị đứt gãy vì vậy chưa chắc các khuẩn lạc này đã mang gen arsC. Để kiểm tra các khuẩn lạc mang gen arsC, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid để
cặp mồi đặc hiệu và đồng thời cắt vector pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI, Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC.
Kết quả tách chiết plasmid từ các chủng biến nạp được thể hiện trên hình 3.12.
Hình 3.12: Kết quả tách chiết plasmid pCambia1301-arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1-4: plasmid tách từ khuẩn lạc sau khi biến nạp
Tiến hành phản ứng PCR pCambia1301-arsC với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển nạp. Đối chứng âm là plasmid pCambia1301 không mang gen arsC. Kết quả PCR được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%.
Hình 3.13: Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen arsC, M:Marker Fermentas 1kb, ĐC: Sản phẩm PCR với khuôn là pCambia 1301, 1-4: Sản phẩm PCR với khuôn là pCambia 1301 - arsC sau biến nạp
Hình 3.13 cho thấy các mẫu 2, 3, 4 cho kết quả dương tính. Vạch băng có kích thước khoảng gần 500bp đúng với kích thước của gen arsC. Mẫu 1 cho kết quả âm tính.
Kiểm tra vector pCambia 1301-arsC bằng enzyme cắt giới hạn
Để khẳng định thêm sự có mặt của gen arsC chúng tôi tiến hành phản ứng cắt pCambia1301- arsC với enzyme NcoI và Eco72I. Kết quả của phản ứng cắt như sau:
Hình 3.14. Sản phẩm cắt pCambia1301-arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I, M:
Marker Fermentas 1kb, 1-3: Sản phẩm cắt pCambia 1301 - arsC bằng enzyme NcoI và Eco72I.
Kết quả điện di của phản ứng cắt cho văng ra 2 vạch băng tương ứng với plasmid pCambia1301 đã loại bỏ gen GUS (kích thước khoảng 9.8 kb) và gen arsC (khoảng gần 500bp) theo như tính toán lý thuyết. Như vậy, kết luận được gen arsC đã được biến nạp thành công vào vector biểu hiện pCambia1301.
Từ kết quả kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen arsC và phản ứng cắt bằng 2 enzyme NcoI và Eco72I, chúng tôi có thể khẳng định vector pCambia1301 - arsC đã được thiết kế thành công.
3.3. Biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301-arsC vào chủng vi khuẩn A.
tumefaciens C58.
Tiến hành biến nạp vector chuyển gen pCambia 1301- arsC vào chủng vi khuẩn A.tumefaciens C58. Chuẩn bị 50àl tế bào A.tumefaciens khả biến và trộn vào 5àl plasmid pCambia1301-arsC đó tinh sạch. Thực hiện phản ứng biến nạp plasmid vào tế bào A.tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Đây là một phương pháp khá hiệu quả trong một thời gian ngắn. Sau đó nuôi phục hồi tế bào và cấy trải trên mụi trường LB cú bổ sung khỏng sinh chọn lọc kanamycin 50àg/ml và rifamycin 50àg/ml ở 28o C trong 2 ngày.
Các khuẩn lạc có thể phát triển trên môi trường kháng sinh chọn lọc nên có thể kết luận chúng mang gen kháng kanamycin. Tuy nhiên, chúng chưa chắc đã mang gen đích như mong muốn vì có thể chứa các plasmid tự đóng vòng. Do đó chúng tôi sử dụng phương pháp Colony- PCR với khuôn là khuẩn lạc để chọn lọc các dòng mang gen mong muốn. Chọn 10 dòng khuẩn lạc tròn, nằm riêng rẽ thực hiện phản ứng Colony – PCR. Kết quả điện di kiểm tra được biểu hiện ở hình 3.15.
Hình 3.15. Kết quả phản ứng Colony- PCR của 10 khuẩn lạc A.tumefaciens C58 được biến nạp pCambia1301- arsC, M: Marker Fermentas 1Kb, 1-10: Sản phẩm Colony - PCR các dòng khuẩn lạc A. Tumefaciens sau biến nạp, ĐC: Sản phẩm Colony -PCR dòng khuẩn lạc A.Tumefaciens chưa biến nạp gen arsC.
Kết quả trên cho thấy, cả 10 dòng khuẩn lạc cho kết quả dương tính và cho cùng kích thước là khoảng gần 500 bp đúng với kích thước của gen arsC. Đối chứng âm là khuẩn lạc A.Tumefaciens không mang gen arsC không cho vạch băng nào. Như vậy, vector pCambia1301-arsC đã được chuyển vào vi khuẩn A.
tumefaciens. Tiếp theo, 10 dòng khuẩn lạc A. tumefaciens này được chúng tôi sử dụng làm nguồn nguyên liệu để chuyển gen arsC vào cây thuốc lá.