CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Tách dòng gen arsC từ RNA của cây dương xỉ Pityrogramma
Lá bánh tẻ cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos lấy từ vùng mỏ than Đại Từ, Thái Nguyên được sử dụng để tách RNA tổng số. Đây là loài dương xỉ đã đươc Viện Công nghệ môi trường xác định là có khả năng hấp thụ và tích lũy Asen cao.
RNA thu được lưu giữ trong nước cất khử trùng có bổ sung 0,01% DEPC. Kết quả kiểm tra RNA tổng số bằng điện di trên gen agarose được thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. RNA tổng số tách từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos chưa xử lý Dnase, M: Marker Fermentas 1kb và 1,2: RNA tổng số chưa xử lý Dnase
Hình 3.1 cho thấy các mẫu RNA từ lá dương xỉ có hàm lượng cao. Sau đó mẫu được xử lý Dnase cho đủ độ tinh sạch để tiến hành phản ứng RT-PCR.
3.1.2. Phản ứng RT-PCR
Phản ứng RT-PCR được tiến hành theo bộ kit tổng hợp cDNA 2 bước của Affymetrix (Mỹ). Cặp mồi khuếch đại gen được thiết kế từ trình tự gen arsC số hiệu X80057.1 trên ngân hàng gen:
Mồi xuôi arsC- NcoI/F được thiết kế với vị trí cắt của enzyme NcoI, mồi ngược arsC- Eco72I/R với vị trí cắt của enzyme Eco72I. Đây là hai enzyme chỉ có
1 2 M
duy nhất một vị trí cắt trên vector pCambia 1301 và không có điểm cắt nào trên đoạn gen mục tiêu để thuận tiện khi nối ghép đoạn gen arsC vào vector chuyển gen trong các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả phản ứng RT-PCR sau khi điện di kiểm tra trên gel agarose 1% được thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR, M: Marker Fermentas 1Kb, ĐC: Phản ứng RT-PCR với mẫu nước cất, 1,2: Phản ứng RT-PCR với mẫu RNA.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm trên hình 3.2 cho thấy xuất hiện đoạn gen đúng với kích thước của gen arsC theo lý thuyết (khoảng gần 500bp). Băng gọn, không có băng, vạch lạ và đủ độ tinh sạch. Như vậy, chúng tôi đã thành công trong việc tách gen arsC từ RNA tổng số của lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos.
3.1.3. Biến nạp cấu trúc gen arsC vào vector tách dòng pBT
Vector pBT là vector tách dòng TA-Cloning với 2 Thyminde ở 2 đầu thuận lợi cho việc gắn gen theo cơ chế tách dòng T-A. Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR có xu hướng gắn Adenin vào mạch mới tổng hợp và không phụ thuộc vào khuôn, do vậy sản phẩm PCR do Taq polymerase tạo ra không có đầu bằng mà có một nucleotide A nhô ra ở đầu 3’. Gen arsC sau khi PCR được gắn trực tiếp vào plasmid theo cơ chế bổ sung A ở sản phẩm PCR với T ở đầu của vector pBT, hình thành liên kết T-A. Vector có chứa gen chọn lọc kháng sinh kháng ampicilin để chọn lọc các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp đồng thời loại trừ các vi khuẩn nhiễm
Gen arsC sau khi được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu arsC- NcoI/F và arsC- Eco72I/R được gắn vào vector pBT bằng phản ứng ligate ở 22oC qua đêm, biến nạp sản phẩm vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Tế bào vi khuẩn biến nạp được nuôi phục hồi trên môi trường LB lỏng trong vòng 2 giờ. Sau đó cấy trải trên môi trường LB đặc cú bổ sung chất khỏng sinh Amp (100àg/ml) để kiểm tra cỏc chủng biến nạp. Nuôi qua đêm ở 37oC. Chọn 10 khuẩn lạc nuôi lắc trong môi trường LB lỏng cú chứa khỏng sinh chọn lọc Amp (100àg/ml) qua đờm. Sau đú tiến hành tỏch chiết plasmid kiểm tra sự có mặt của pBT, đồng thời tiếp tục nuôi lỏng các dòng vi khuẩn này. Sau khi tách chiết plasmid, xử lý plasmid với Rnase, tinh sạch rồi điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả cho các băng rõ và đúng với kích thước của plasmid pBT đã biến nạp thêm gen arsC (~3.2 kb).
Hình 3.3. Kết quả tách chiết plasmid pBT- arsC, M: Marker Fermentas 1kb, 1- 10: Plasmid tách được từ các dòng khuẩn nạp sau khi biến nạp, ĐC: Mẫu đối chứng là plasmid tách từ khuẩn lạc không biến nạp
3.1.4. Kiểm tra vector pBT-arsC
Để chắc chắn sự có mặt của gen arsC trong vector tách dòng pBT chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR và cắt bằng enzyme giới hạn.
Kiểm tra vector pBT-arsC bằng phản ứng PCR
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi arsC-NcoI/F và arsC-EcoR72I/R. Mẫu đối chứng là plasmid pBT không mang gen arsC. Kết quả phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả PCR pBT-arsC với cặp mồi đặc hiệu, M: Marker Fermentas 1kb, ĐC: Sản phẩm PCR vector pBT không mang gen arsC, 1-9: Sản phẩm PCR vector pBT- arsC
Kết quả phản ứng PCR cho các băng đúng với kích thước gen arsC theo tính toán lý thuyết (gần 500bp). Để khẳng định thêm nữa sự có mặt của gen arsC trong vector pBT chúng tôi tiến hành kiểm tra đồng thời bằng các enzyme cắt giới hạn.
Kiểm tra vector pBT-arsC bằng enzyme cắt giới hạn BamHI
Vector tách dòng pBT có chứa 2 điểm cắt của enzyme BamHI ở 2 đầu gắn gen, thuận tiện cho việc kiểm tra gen gắn. Theo tính toán lý thuyết thì sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sẽ cho hai đoạn có kích thước đoạn 1 là gen arsC và đoạn còn lại bằng với kích thước chiều dài vector pBT. Kết quả điện di sản phẩm cắt pBT- arsC bằng enzyme BamHI (Hình 3.5) cho thấy cả 4 plasmid đều thu được các phân đoạn có các kích thước tương ứng với dự tính, chứng tỏ đã thành công trong việc nối ghép gen arsC vào vector nhân dòng pBT .
Hình 3.5. Kết quả cắt pBT-arsC bằng BamHI, M: Marker Fermentas 1kb,1-4:
Sản phẩm cắt pBT-arsC bằng BamHI.
Còn một cách kiểm tra bằng enzyme NcoI và Eco72I cũng được chúng tôi tiến hành. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen arsC được thiết kế với 2 điểm cắt của 2 enzyme giới hạn NcoI và Eco72I ở 2 đầu. Do vậy dễ dàng cắt pBT-arsC bằng các enzyme giới hạn NcoI và Eco72I để kiểm tra sự có mặt của gen arsC. Kết quả phản ứng cắt cho ra 2 vạch băng tương ứng với vector pBT ( khoảng 2.7kb) và gen arsC (khoảng gần 500bp) (Hình 3.6). Như vậy hoàn toàn có thể khẳng định vector pBT-arsC đã được thiết kế.
Hình 3.6. Kết quả cắt pBT-arsC bằng NcoI và Eco72I, M: Marker Fermentas 1kb, 1-4: Sản phẩm cắt pBT- arsC bằng NcoI và Eco72I
3.1.5. Xác định trình tự gen trình tự gen arsC
Để khẳng định chính xác đoạn DNA nhân bản và nhân dòng vào vector pBT đúng là đoạn gen mục tiêu, vector tái tổ hợp pBT-arsC được gửi đi giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc) bằng cặp mồi arsC- NcoI/F và arsC- Eco72I/R. Sau đây là kết quả giải trình tự chúng tôi nhận được:
GGCCGGAAGGGGTGCAGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCACTCTTTACATGGACTGATATGAGCAACATTACCATTTATCA CAACCCGGTCTGCGGCACGTCGCGTGGAGATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACT CCGCCAACGCGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGTAAAAACGTCGA ACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGGTTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTC TGATTAATCGCCCGATTTGGTGACGCCGCTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTGCCAGAT GCGCAAAAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTGAAATAA GCTAGCTAAAGCTTGGATCCCCGGGTACCGAGCTAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC GCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACA TTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCG GGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA GCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAA AAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCA TCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGC
CTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTC AGCCCGACCGCTGGGCCTTATCCGGGAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACCCGACTATCGCCACTGGCAGCAG CCACTGGTAACAGGATTACCAAACCGGGG
So sánh trình tự nucleotide đoạn gen thu được với trình tự gen gốc mang mã số X80057.1 trên Gene Bank bằng phần mềm DNAstar và BioEdit cho kết quả độ tương đồng về trình tự nucleotide là 99%, độ che phủ 100% (hình 3.7). Số nucleotide sai khác là 1/426 nu (nucleotide số 32 thay C bằng T). Điều này chứng tỏ đã phân lập được chính xác đoạn gen arsC mong muốn ở cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos.
Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident Links
59375 782 782 100% 0.0 99%
>lcl|59375 Length=426
Score = 782 bits (423), Expect = 0.0 Identities = 425/426 (99%), Gaps = 0/426 (0%) Strand=Plus/Plus
Query 1 ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGTCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 ||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 1 ATGAGCAACATTACCATTTATCACAACCCGGCCTGCGGCACGTCGCGTAATACGCTGGAG 60 Query 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 61 ATGATCCGCAACAGCGGCACAGAACCGACTATTATCCATTATCTGGAAACTCCGCCAACG 120 Query 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 121 CGCGATGAACTGGTCAAACTCATTGCCGATATGGGGATTTCCGTACGCGCGCTGCTGCGT 180 Query 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 181 AAAAACGTCGAACCGTATGAGGAGCTGGGCCTTGCGGAAGATAAATTTACTGACGATCGG 240 Query 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 300 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 241 TTAATCGACTTTATGCTTCAGCACCCGATTCTGATTAATCGCCCGATTGTGGTGACGCCG 300 Query 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 301 CTGGGAACTCGCCTGTGCCGCCCTTCAGAAGTGGTGCTGGAAATTCTGCCAGATGCGCAA 360 Query 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG 420 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 361 AAAGGCGCATTCTCCAAGGAAGATGGCGAGAAAGTGGTTGATGAAGCGGGTAAGCGCCTG 420 Query 421 AAATAA 426
||||||
Sbjct 421 AAATAA 426
Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen phân lập từ lá cây dương xỉ Pityrogramma calomelanos với trình tự được công bố trên ngân hàng gen NCBI (X80057.1).
Tiếp tục so sánh trình tự axit amin suy diễn của đoạn gen arsC phân lập được với trình tự axit amin của gen gốc (Hình 3.8) cho thấy có một sự thay đổi ở axit amin số 11 trong đó A (alanin) được thay bằng V(valin).
Hình 3.8. Độ tương đồng các axit amin khi so sánh 2 trình tự
Như vậy, có thể sử dụng đoạn gen arsC trong vector nhân dòng pBT-arsC cho nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector chuyển gen.