2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.1.7. Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro
Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì:
Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối tương quan mới được hình thành.
Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:
Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa tế bào).
Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra.
Sự hình thành cơ quan
Sự phát triển cơ quan
Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố:
Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoài thiên nhiên
Vị trí của mẫu cấy trên cây
Thời gian thu mẫu trong năm
Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh
Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phần dưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,… sự bổ sung một số cơ chất khác vào trong môi trường,…
Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô rất phức tạp, chúng ta không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý đến một số vấn đề sau:
Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau (môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,…).
Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loài khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau.
Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khác nhau:
trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết định do đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không nhiều.
Sự hình thành rễ bất định thường đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếu sót. Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất định trước sau đó cảm ứng tạo rễ.
2.1.7.1. Sự hình thành chồi bất định
Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như một phương pháp nhân giống vô tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn.
Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như:
Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin…
Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất định và tạo rễ bất định:
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng các bộ phận của cây con (Anonymous, 1984).
Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ).
Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định
Ánh sáng
Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ là có một số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii (Pierik, 1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read (1986) cho biết rằng các mẫu cấy lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên môi trường không có cytokinin và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi có trọng lượng tươi lớn hơn là được nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trên môi trường có BA thì khi xử lý với ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng lượng tươi của chúng tương tự nhau và nhiều hơn trên môi trường không có cytokinin.
Nhiệt độ
Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp:
Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin để tạo chồi bất định như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966).
Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi auxin lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch, 1968).
Có một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó là trường hợp Lili (van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975).
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965) và cây bông cải (Margara, 1969).
Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự tái sinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai chất điều hòa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều loài thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng).
Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969). Một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948).
Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas.
2.1.7.2. Sự hình thành rễ bất định
Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô của chúng còn giữ khả năng phân sinh.
Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền của loài, tuổi của mẫu, vị trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, số lần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH,…