Mẫu lá Kim Ngân sau khi được khử trùng sơ bộ bên ngoài tủ cấy dưới vòi nước chảy và nước rửa chén pha loãng sẽ làm giảm đáng kể nguồn gây nhiễm, giúp cho sự khử trùng được dễ dàng hơn, sau đó được đưa vào tủ cấy để tiến hành khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung vài giọt Tween 20 với các khoảng thời gian khác nhau.
Mẫu lá sau khi khử trùng sẽ được cắt bỏ viền xung quanh lá bị trắng, nâu do tác dụng của chất khử trùng, cắt đôi lá theo đường gân chính thu được mẫu có kích thước 1 – 2 cm và cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l NAA. Tỉ lệ mẫu bị nhiễm được ghi nhận sau 1 tuần và tiếp tục đánh giá tỉ lệ mẫu tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy.
Trong 1 tuần nuôi cấy đầu tiên cho kết quả khử trùng như bảng 4
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa Nghiệm thức Thời gian
(phút)
Tỉ lệ mẫu nhiễm(%)
Tỉ lệ mẫu chết (%)
Tỉ lệ mẫu sống (%)
1 3 20a (*) 0b 80b
2 4 8ab 0b 92ab
3 5 0b 0b 100a
4 6 0b 4ab 96a
5 7 0b 8ab 92ab
6 8 0b 12a 88ab
(*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05
Khi tiến hành nuôi cấy mô thực vật thì vấn đề lớn nhất là phải tạo được nguồn mẫu nuôi cấy đảm bảo vô trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các các thí nghiệm sau. Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin thì rất thích hợp cho các loài nấm, vi khuẩn phát
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
triển do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật.
Nếu do nấm, chúng ta thấy sự phát triển của khuẩn ty có cấu trúc sợi, thường màu trắng hoặc hơi xám. Nếu sợi khuẩn ty màu xanh, chắc chắn là do nấm penicillium. Nếu sợi thể hiện các hạt đen nhỏ (dạng quả), có thể là do nấm rhizopus nigricans, nấm này sẽ sinh sôi rất nhanh.
Nếu do khuẩn, thì chúng ta sẽ thấy một màng có dạng sữa, phát triển bên trong môi trường và ở bề mặt. Màng này đôi lúc có màu (như hồng, vàng,…). Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas….
Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mô và môi trường cấy thì đây là nhiễm do mô. Nếu sự nhiễm khởi đi từ một điểm bất kỳ nào đó trong môi trường thì nguồn nhiễm có thể do không khí hoặc sự khử trùng môi trường không tốt hoặc do nhiễm từ không khí xung quanh. (Dương Công Kiên, 2002)
Do đó, các mẫu cấy cần phải được khử trùng bằng các tác nhân khử trùng hóa học.
Các chất khử trùng phải ức chế hoặc phá hủy sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hiệu lực của các chất khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy và có độc tính thấp đối với mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì ta có thể thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật, như vậy, bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006)
Từ bảng 4.1 cho thấy, khi thời gian khử trùng 3 – 4 phút thì chưa đủ để tạo ra được mẫu cấy vô trùng, tỉ lệ mẫu bị nhiễm nấm và vi khuẩn khá cao. Trong khi đó, thời gian khảo sát 5 phút cho thấy kết quả khả quan, đủ để tiêu diệt vi khuẩn và các bào tử nấm mà không làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của mẫu cấy, tạo được khối lượng lớn các mẫu lá vô trùng.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Cơ chế tác động của chất khử trùng là: phá hủy lớp màng phospholipid, phân hủy lipid và acid béo, hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật; gây oxy hóa ức chế không thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật.
Khi hypoclorit hoà tan trong nước, chúng sinh ra a c i d h y p o c l o r ơ ( HOCl), chất này sẽ tồn tại trong dung dịch ở 2 dạng OCl- và H+. Hai dạng này sẽ chuyển hoá qua lại, tùy theo độ pH của dung dịch.
Acid hypoclorơ tồn tại trong dung dịch, sẽ tác động đến các chất hữu cơ như là một chất hoà tan, hình thành clorua là một chất oxy hoá mạnh sẽ thay thế nhóm hydro (H) trong nhóm amino (NH) của protein hình thành chloramine dẫn đến sự phá huỷ amino acid, làm biến tính protein. Tính nguyên vẹn của màng nguyên sinh chất bị thay đổi, phospholipid hoặc các acid béo không no của màng tế bào vi sinh vật bị phân huỷ do quá trình xà phòng hoá (Estrela và cộng sự, 2002).
Kết quả cũng cho thấy, khi tăng thời gian khử trùng mẫu cấy 6 – 8 phút thì mẫu không bị nhiễm nhưng tỉ lệ mẫu sống thấp. Mẫu bị chết do Javel ngấm sâu vào mô tế bào làm cho mô tế bào bị phá hủy.
Như vậy, thời gian khử trùng thích hợp nhất đối với mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa là 5 phút với tỉ lệ mẫu có khả năng sống sót và tái sinh là 100%. (Bảng 4.1)
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của cách đặt mẫu cấy lên sự phát sinh hình thái sau 1 tháng nuôi cấy
Cách đặt mẫu lá trên môi trường Trọng lượng tươi mô sẹo (g)
Úp 0.103017b
Ngửa 0.229317a
Mục đích thí nghiệm đặt ra là nhằm xác định được cách đặt mẫu cấy lên bề mặt môi trường để thu được kết quả cho phát sinh mô sẹo tốt nhất trong thời gian ngắn nhất.
Sau 1 tháng nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 1 BA – 1 NAA, kết quả cho thấy khi đặt mặt dưới của lá tiếp xúc với môi trường (đặt ngửa) thì mẫu cấy phát sinh mô sẹo từ vết cắt, gân lá và trên bề mặt của lá. Các mẫu cấy khác khi đặt mặt trên của lá tiếp xúc với môi trường (đặt úp) thì trong 1 tháng nuôi cấy đầu tiên mô sẹo chỉ phát sinh từ vết cắt, mặt trên của lá lại rất ít và chậm hơn rất nhiều, đôi khi không có sự phát sinh mô sẹo so với khi đặt mặt dưới của lá lên môi trường.
Ở cây Cydonia oblong, Morini và cộng sự (2001) đã nghiên cứu sự phát sinh mô sẹo từ mẫu cấy lá, kết quả cho thấy mô sẹo chỉ hình thành trên bề mặt của lá Cydonia oblong. Tương tự như nghiên cứu của Rita and Floh (1995) với mẫu cấy lá Cuphea ericoides. Như vậy, sự hình thành mô sẹo trong 1 vài trường hợp thì bị ảnh hưởng bởi sự định hướng của mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy (Warren, 1991).
Sự khác biệt giữa 2 cách đặt mẫu lá trên môi trường có thể giải thích dựa vào cấu trúc của lá. Mặt dưới lá thường có lớp cutin mỏng hơn và nhiều khí khổng hơn (Bùi Trang Việt, 2002; Nguyễn Đình Giậu, 2000). Do đó, khi đặt trong môi trường nuôi cấy, mẫu lá đặt ngửa sẽ hấp thu nhiều chất dinh dưỡng cũng như các thành phần khác của môi trường hơn. Tác dụng của điều kiện nuôi cấy dễ dàng phát huy hơn. Trên lá, chủ yếu phần gân cuối lá bị tổn thương do sự cắt ra khỏi cuống. Khi đặt mẫu lá ngửa, phần gân này được tiếp xúc nhiều với môi trường và hấp thu các chất nhanh hơn những vị trí khác của lá. Và lúc này, chúng trở thành các "bể" thu hút chất dinh dưỡng cũng như những chất khác từ các nơi đổ về.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Đồng thời khi quan sát lá trong thời gian đầu nuôi cấy nhận thấy có sự cong đặc trưng của phiến lá. Lá có xu hướng cong lên khi đặt ngửa và cong xuống khi đặt úp. Từ đó có thể kết luận các tế bào lá ở mặt trên nhạy cảm và phản ứng tốt hơn.
Pierik và Zwart chứng minh rằng sự tạo chồi bất định của mẫu cấy lá tăng nhiều khi để cho lớp biểu bì dưới của phiến lá Kalanchoe farinacea tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy (đặt ngửa).
Từ bảng 4.2 cũng cho thấy trọng lượng tươi của mô sẹo đạt được trong 1 tháng cũng có sự chênh lệnh đáng kể. Đối với mẫu cấy đặt ngửa thì trọng lượng tươi của mô sẹo tăng lên là 0.229317g/mẫu trong khi đặt úp thì chỉ có 0.103017 g/mẫu. Điều này chứng tỏ rằng, sự định hướng của mẫu cấy ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa.
Như vậy, đối với mẫu lá Kim Ngân Hoa thì khi đặt ngửa thì khả năng mẫu phát sinh mô sẹo từ vết cắt, gân lá và trên cả bề mặt của lá tốt hơn và khối lượng mô sẹo tăng sinh nhanh so với khi đặt úp.
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp với 2,4-D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa 4.3.1. Thí nghiệm 3.1: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA
kết hợp với 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa
Bảng 4.3. Anh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1 tháng nuôi cấy
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Nghiệm thức Nồng độ (mg/l) Trọng lượng tươi mô sẹo (g)
1 A1 0.5335 e
2 A2 0.78006 bc
3 A3 0.68716 cd
4 A4 0.53418 e
5 A5 1.28192 a
6 A6 0.77308 bc
7 A7 0.6321 e
8 A8 1.21554 a
9 A9 0.77334 bc
10 A10 0.53132 e
11 A11 0.49182 e
12 A12 0.7692 bc
13 A13 0.35552 e
14 A14 0.68274 cd
15 A15 0.85406 b
Kết quả ghi nhận sau 1 tháng nuôi cấy cho thấy các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng chuyên biệt lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin.
Đối với Kim Ngân Hoa là cây bụi hay dây leo, ít thấy cây thân thảo thì quá trình nuôi cấy in vitro sẽ khó cảm ứng hơn các dạng cây thân thảo nên sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là điều cần thiết. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu trên tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0,5 mg/l và BA 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo ; lá của Solanum tuberosum L. cần có sự phối hợp giữa 2,4-D 3,0 mg/l, NAA 1,0 mg/l và kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Có một số công trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey, 1977 trên mô rễ cây đậu nành, ghi nhận có sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu môi trường chỉ có auxin, thì hàm lượng DNA được ghi nhận là không thay đổi.
100% mẫu lá phát sinh mô sẹo khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA và 2,4-D. Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Tuy nhiên, khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Chỉ có cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành là dễ cho mô sẹo dưới tác động của auxin mạnh được áp dụng riêng lẽ hay kết hợp với cytokinin, còn những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng này. Ưng với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó (Ochatt và Caso, 1986)
Đối với Kim Ngân Hoa thì lá là cơ quan cho phát sinh mô sẹo tốt nhất bởi độ đồng đều của các tế bào lá cao hơn do các tế bào lá phân chia đều khắp bề mặt (Bùi Trang Việt, 2000), cũng là cơ quan cho phát sinh chồi nhiều nhất. Nếu tính theo số lượng tế bào biểu bì, dưới biểu bì (chồi bất định thường phát sinh từ những tế bào này, theo Joy
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
IV và Thorpe, 1999; Bùi Trang Việt, 2000) thì mẫu lá có số lượng lớn hơn thân và rễ. Do đó, chồi phát sinh cơ bản là nhiều hơn.
Điều này đã được chứng minh bởi nghiên cứu của D. Georges (1993) và cộng sự trên cây Kim Ngân Hoa. Bề mặt tiếp xúc của mẫu lá với môi trường lớn hơn, bề dày mẫu cấy nhỏ hơn nên chênh lệch gradient của các chất cảm ứng cũng ít hơn. Theo Joy IV và Thorpe (1999), sự tương tác giữa gradient các chất cảm ứng là một yếu tố quan trọng trong quá trình phát sinh cơ quan. Mẫu cấy càng đồng đều về gradient sẽ cho phản ứng càng thống nhất và hiệu quả.
Điều quan trọng được nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh.
Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn : phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa.
(1) Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
(2) Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối.
(3) Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison, 1997). Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây... hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ.
Khi đặt mẫu lá trong môi trường MS cơ bản, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì mẫu lá phồng lên, xanh nhưng sau 1 thời gian thì mẫu lá bắt đầu hóa nâu và chết, điều này có thể là do lượng hormon nội sinh trong mẫu cấy ít, không đủ để cảm ứng quá trình phát sinh hình thái. Điều này cũng được ghi nhận bởi Klimaszewska
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
và Keller (1985) khi nuôi cấy các TLC của cây Brassica napus trên môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng.
Khi mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các loại chất điều hòa sinh trưởng khác nhau cho thấy các kết quả có sự khác biệt rõ ràng.
Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo (Ahloowalia, 1991 ; Komamin và cộng sự, 1992 ; Liu và cộng sự, 1993 ; Zimmerman, 1993). 2,4-D đã được chứng minh có vai trò quyết định đến sự phát sinh mô sẹo có khả năng phát sinh phôi ở cây cà rốt (Borkid và cộng sự, 1986) và sự phát sinh phôi sinh dưỡng ở hầu hết các loài thực vật (Halperin và Whetherell, 1964 ; Ammirato, 1983). Kết quả ghi nhận cho thấy 2,4-D với nồng độ 0,1 mg/l kết hợp với BA cho khả năng phát sinh mô sẹo tốt nhất, mô sẹo hình thành xung quanh vết cắt và trên khắp bề mặt của lá, tạo thành bông trắng, và nâu, nốt xanh trên bề mặt lá, mẫu lá sẽ uốn cong thành dạng V với gân chính là điểm mấu chốt do sự tăng sinh tế bào, mẫu lá chắc, mặc dù trọng lượng tươi của mô sẹo ở nồng độ này là 0.6321 g/mẫu thấp hơn so với các nồng độ còn lại. Khi nồng độ 2,4-D càng cao (0,5 – 1 mg/l) thì mô sẹo trở nên trắng đục, nhão không có khả năng tái sinh, nhưng trọng lượng tươi của mô sẹo lại tăng lên đáng kể, những loại mô sẹo dạng như vậy tăng sinh rất nhanh và cần phải được loại bỏ. Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ của auxin (Bonner và Galston, 1959 ; De Garcia và Martnez, 1995 ; Grant và Fuller, 1968). Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Ceriani và cộng sự, 1992).
Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi (Mehra và Jaidka, 1985 ; Pal và cộng sự, 1985 ; Shrikhande và cộng sự, 1993). Kết quả cho thấy nồng độ BA 1 mg/l cho khả năng tái sinh tốt hơn các nồng độ còn lại.
Như vậy, nồng độ 0,1 mg/l 2,4-D kết hợp với 1 mg/l BA là nồng độ thích hợp cho sự phát sinh mô sẹo ở mẫu lá Kim Ngân Hoa. Đây là tiền đề cho các thí nghiệm nghiên