4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp với 2,4 D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa
4.3.2. Thí nghiệm 3.2 : Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng
Bảng 4.4. Anh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1 tháng nuôi cấy
Nghiệm thức Nồng độ (mg/l) Trọng lượng tươi mô sẹo (g)
1 B1 0.192228 e
2 B2 0.94526 cd
3 B3 1.0575 b
4 B4 0.5967 e
5 B5 0.84984 e
6 B6 0.98806 bc
7 B7 0.817 e
8 B8 0.8757 e
9 B9 1.5339 a
10 B10 0.73264 e
11 B11 0.8935 e
12 B12 0.97728 bc
13 B13 0.62436 e
14 B14 0.754506 e
15 B15 0.89754 e
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Từ bảng 4.4 cho thấy sự kết hợp giữa BA và NAA cho phát sinh mô sẹo tốt hơn rất nhiều so với khi BA kết hợp với 2,4-D và trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên đáng kể. 100% mô sẹo cũng được phát sinh từ sự kết hợp này. Điều này chứng tỏ, ở cây Kim Ngân Hoa thì lá là cơ quan rất dễ cảm ứng tạo mô sẹo. Một tiến trình phản biện hóa phát sinh dẫn đến kết quả hình thành mô sẹo có tính cạnh tranh dọc theo bìa vết cắt. Tất cả mô sẹo thu được đều rắn chắc, mô sẹo nâu, trắng, vàng, và có nhiều nốt xanh trên bề mặt của lá. Không có sự tái sinh chồi trong suốt quá trình khởi đầu của mô sẹo nhưng rễ xuất hiện thường xuyên trên môi trường cơ bản chứa NAA. Điều này có thể được giải thích vì hàm lượng auxin nội sinh của cây khá cao, đồng thời NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh nên khi bổ sung 1 hàm lượng rất nhỏ của NAA cũng đã có khả năng cảm ứng mô sẹo phát sinh rễ.
Ở nồng độ 0,5 mg/l NAA thì cho sự phát sinh rễ từ khối mô sẹo nâu và sự phát sinh rễ càng nhiều trên môi trường chứa (0,5 mg/l BA + 1 mg/l NAA) có trọng lượng tươi là 1.0575 g/mẫu hoặc (0.7 mg/l BA + 1 mg/l NAA) có trọng lượng tươi của mô sẹo là 0.98806 g/mẫu, tỉ lệ A/C cao thì kích thích tạo rễ (Bi Trang Việt, 2000). Điều này cũng được bắt gặp khi nuôi cấy mẫu lá Crassula argentea đáp ứng với vết thương bằng cách tạo mô sẹo, sau đó sẽ tạo rễ và tiếp theo là tạo chồi (Paterson và Rost, 1981)
Sự hình thành rễ bất định chia làm 3 giai đoạn:
a) Giai đoạn đầu là sự tái phân chia của mô phân sinh bên tức là một số tế bào xảy ra sự phản phân hoá mạnh ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm mống của rễ.
b) Giai đoạn tiếp theo là sự xuất hiện mầm rễ.
c) Giai đoạn cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ chui qua vỏ ngoài tạo nên rễ bất định.
Các giai đoạn này khác nhau về yêu cầu đối với auxin. Giai đoạn đầu đòi hỏi hàm lượng auxin cao để khởi xướng sự phản phân hoá tế bào mạnh mẽ. Giai đoạn hai cần hàm lượng auxin thấp hơn cho sự xuất hiện rễ. Giai đoạn ba sự sinh trưởng của mầm rễ
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
để hình thành rễ đòi hỏi hàm lượng auxin rất thấp, thậm chí auxin có thể gây ức chế sự sinh trưởng của rễ.
Đối với cây Kim Ngân Hoa, sự phát sinh rễ còn chịu tác động rất lớn bởi nhiệt độ cao (> 300C) và trong điều kiện tối thì rễ sẽ phát sinh nhiều và tốt hơn trong điều kiện ngược lại (D. Georges và cộng sự, 1993). Điều này được giải thích là do khi duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thì làm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng có thể làm tăng hiệu quả của auxin. Tương tự như trường hợp đối với mẫu cấy lá Begonia khi Heide (1965) quan sát thấy rằng mức độ hoạt động của cytokinin sẽ giảm xuống khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện 270C so với khi được nuôi ở nhiệt độ 150C.
Khi tăng nồng độ BA lên 1 mg/l kết hợp với 1 mg/l NAA thì mẫu lá phát sinh mô sẹo tốt nhất với trọng lượng tươi của mô sẹo cao nhất là 1.5339 g/mẫu so với các nồng độ còn lại. Mô sẹo hình thành nhanh và nhiều khắp bề mặt và xung quanh vết cắt của lá, mô sẹo xanh, vàng nhạt, nâu nhạt, khối lượng mô sẹo tăng sinh nổi bật, mô sẹo xốp chắc thành khối, mẫu lá cứng và không có sự phát sinh rễ từ nồng độ này. Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần một đơn vị sẽ thu được sinh tạo mô sẹo.
Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau 1 thời gian nuôi cấy thì nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hoàng Anh, 2000).
Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao: kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1: kích thích tạo mô sẹo, từ những mô sẹo này sau đó hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp: kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C sẽ xác định sự tạo cơ quan : tỷ lệ cao : tạo chồi, tỉ lệ thấp : tạo rễ. (Skoog và Tsui, 1948 ; Miller và Skoog, 1953 ; Paulet, 1965 ; Gautheret, 1959).
Trong nuôi cấy mô, cytokinin cần thiết cho sự phân chia của tế bào mẫu cấy. Khi không có cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì metaphase của chu trình tế bào sẽ bị
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
kéo dài vì vậy cytokinin cần thiết trong sự điều hòa sinh tổng hợp protein tế bào trong sự tăng trưởng và phát triển của tế bào.
Khi tăng nồng độ của BA lên 1,5 mg/l kết hợp với 0,5 mg/l NAA thì không thấy sự phát sinh rễ, và với nồng độ 1 mg/l NAA thì sự phát sinh rễ ít, mô sẹo nâu hình thành nhanh và nhiều xung quanh vết cắt, các nốt xanh hình thành trên bề mặt của lá, khối bông trắng xuất hiện từ vết cắt, mẫu lá cứng, xanh, chắc, phát sinh tốt. Khi gia tăng hàm lượng cytokinin trong mô thì hiện tượng ưu tính ngọn bị phá vỡ sự bật chồi được kích thích bởi cytokinin; trái ngược với tác động của auxin (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. BA là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật, tuy nhiên khi sử dụng BA với nồng độ cao thì sẽ tạo ra những chồi khơng bình thường. Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái.
Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cộng sự, 2003). Kết quả này đã được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003).
Trong sự khởi đầu và điều hoà sự tăng trưởng của cơ quan chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò quan trọng. Khi nuôi cấy trên môi trường có cytokinin và auxin thì sự phát triển chồi được kích thích. Cần có một sự cân bằng về nồng độ của từng loại hormone trong từng loại mô, ở từng vị trí chuyên biệt. Nhiều loại thực vật như cây thuốc lá đòi hỏi auxin và cytokinin ngoại sinh với tỷ lệ hợp lý để tạo chồi.
Sau 1 tháng nuôi cấy, mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường chứa BA có nồng độ cao hơn, cho thấy mô sẹo cảm ứng tốt, nhưng vẫn chưa thấy sự phát sinh chồi trong suốt thời gian nuôi cấy, tuy nhiên đây là tiền đề cho việc nghiên cứu sự tạo chồi và tái sinh cây hoàn chỉnh cho cây Kim Ngân Hoa sau này.
SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên
Kim Ngân Hoa là dạng cây dây leo, thân gỗ nên khả năng cảm ứng chồi từ mô sẹo khó hơn các loài cây thân thảo khác và phải cần rất nhiều thời gian. Theo nghiên cứu bởi D. Georges (1993) và cộng sự cho thấy sau 6 tháng trên môi trường nuôi cấy mô sẹo thì mô sẹo từ lá mới hình thành chồi và cho tỉ lệ hình thành chồi cao hơn so với mô sẹo từ rễ, thân và thời gian hình thành chồi ít nhất (75 ngày).
Với những bước tiến về vi nhân giống và kỹ thuật di truyền, đã có hàng trăm loài thực vật đã được nuôi cấy thành công in vitro trên nhiều loại mô khác nhau và phát sinh cơ quan có cấu trúc (Bajaj, 1986). Tuy nhiên, có nhiều loài thực vật khó nuôi cấy, không hình thành rễ, chồi hay phôi trong nhiều điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Điều quan trọng là cần nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh nếu khả năng phát triển kỹ thuật di truyền mang tính khả thi. Đã có nhiều báo cáo với những phương pháp nghiên cứu tái sinh các loài thực vật đặc biệt, những phương pháp này cần nhiều thời gian để phát triển vì chúng ta không có một nền tảng kiến thức cơ bản để có thể hiểu rõ tiến trình tái sinh phát sinh hình thái. Hơn nữa, kiến thức chúng ta thu nhận được qua việc vận dụng thành công một loài thực vật hay một giống cây trồng trọt thì thường không thể nào áp dụng cho các loài thực vật hay các giống cây trồng khác mặc dù thực vật gần nhau về mặt di truyền.
Việc phát triển các mô hình nuôi cấy tái sinh thành công in vitro ở những loài thực vật khó tái sinh sẽ hữu ích trong việc nâng cao tầm hiểu biết của chúng ta về những cơ chế cơ bản điều khiển phát sinh hình thái.