Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro

2.1.8.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường. Thành phần này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy.

Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đổi. Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy.

Tuy nhiên, tất cả các môi trường đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

 Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là N, P, KáCa, Mg và Fe.

 Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít nghiên cứu. Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời, người ta

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy. Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môi trường nuôi cấy. Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo...

 Carbon và nguồn năng lượng: trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính từ nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose. Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose. Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy.

 Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng. Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol.

 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ dại.

Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế.

Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và etylen:

 Auxin

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N. Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D,...).

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng khác.

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+.

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp RNA ribosome.

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo.

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzyme auxin – oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng.

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004).

 Cytokinin

Cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin và 2iP) được phát hiện sau auxin và gibberellin.

Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP.

Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện của auxin:

auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách rời nhiễm sắc thể.

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ.

Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn.

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy in vitro.

 Gibberellin

Gibberellin cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3. Đây là các chất có cấu trúc nội sinh.

Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất thế trên nhân.

Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt cây. Tác động này cũng có thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hơn hoặc những phát hoa phát triển hơn (trên các loài nho có chùm nhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thoáng hơn).

GA3 được sử dụng trong môi trường dinh dưỡng kích thích vươn thân, đặc biệt trong trường hợp có hàm lượng cytokinin cao dẫn đến việc hình thành các cụm chồi có cấu trúc chặt (Economou, 1982).

Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt, chẳng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác.

 Etylen

Gia tăng quá trình rụng lá và trái; với mục đích này, nó được sử dụng để cho phép thu hoạch cơ giới trái (thí dụ trái olive, cerise…).

Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa.

Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ.

Tất cả các bộ phận của cây đều có khả năng tổng hợp etylen, quan trọng nhất là trái cây, kém hơn là hoa và ở các cơ quan thực vật bị chấn thương.

 Abscisic acid

Acid abscisic (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuôi cấy phôi.

Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium (K+), do tác động này nó đã ảnh hưởng trên sự đóng mở khí khổng của tế bào.

Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nó có thể bị ức chế hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago). Áp dụng trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi (như cây Epinard, Lolium temulentum).

Trong nuôi cấy mô, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây và phần khác tùy các điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khó khăn.

Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog:

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinh tạo rễ.

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân.

SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

- Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mô sẹo.