2.2.1. Hóa chất sử dụng
Hóa chất sử dụng bao gồm: MIA (methyl immidazole), EDC (1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide), Natri Hydrogen phosphate (Na2HPO4), Kali dihydrogen phosphate (KH2PO4), natri clorua (NaCl), Kali clorua (KCl), Natri Hydroxit (NaOH), Axit sunphuric (H2SO4), ethanol (C2H5OH).
Hai loại ARN: ARN1 để các nhóm phosphate tự do ở vị trí 3’ sau các Adenine (5'-TCTTGTGTCCAGGCATCCCTAAAAAAAAAA-3’-Phosphate) và ARN2 (Phosphate-5'- AAAAAAAAAAGCCTCGGTTGTGACAGAG-3’) có các nhóm phosphate tự do ở vị trí 5’ đƣợc đặt hàng thiết kế bởi PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh (khoa Sinh học – Đại học Khoa học tự nhiên) với 10 Adenine lặp lại).
ARN1, ARN2 là hai phân tử ARN có khả năng liên kết đặc hiệu với ADN vủa virus EBV.
EDC, MIA đặt hàng từ BioBasic, lưu trữ trong tủ 4oC. Dung môi nước sử dụng là nước cất 2 lần được khử trùng. Dung môi PBS được pha theo công thức 1X thể hiện trong Bảng 2.5.
26
Muối Nồng độ (mmol/L) Nồng độ (g/L)
NaCl 137,00 8,00
KCl 2,70 0,20
Na2HPO4 10,00 1,42
KH2PO4 1,80 0,24
Bảng 2.5. Nồng độ các hóa chất sử dụng để pha dung môi PBS 1X.
Natri Hydrogen phosphate (Na2HPO4), Kali dihydrogen phosphate (KH2PO4), natri cloride (NaCl), Kali cloride (KCl), Natri Hydroxit (NaOH), Axit sulfuric (H2SO4), ethanol (C2H5OH) đƣợc sử dụng với độ tinh sạch tin cậy.
2.2.1. Quy trình khảo sát khả năng gắn kết của vật liệu với các phân tử ARN Trong quá trình khảo sát chế tạo hạt nao ZnS sử dụng chất hoạt hóa bề mặt 4-ATP, nhóm nghiên cứu chúng tôi nhận ra rằng, ZnS đã đƣợc chức năng hóa với nhóm chức amin ngay trong quá trình chế tạo. Cơ chế hình thành hạt ZnS-4ATP diễn ra nhƣ sau:
Để có thể ứng dụng trong cảm biến ADN, nhóm nghiên cứu đã tiến hành gắn kết các hạt nano ZnS-4ATP với các phân tử ARN2 bằng phản ứng liên kết cộng hóa trị thông qua hỗ trợ xúc tác của MIA (methyl immidazole) và EDC (1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide).
Quá trình thực hiện đƣợc tiến hành cụ thể nhƣ sau: 2 mg EDC đƣợc cho vào 1 ml MIA trong ống ependorf và lắc đều cho đến khi tan hết; 1 mL ARN2 nồng độ 25 μM đƣợc hòa tan vào trong 5 mL dung dịch PBS pH 7.0 (chứa trong một ống nghiệm nhỏ có thể tích 20 mL). Sau đó 0,5 mL dung dịch ZnS-4ATP đƣợc nhỏ vào trong ống nghiệm, lắc đều. Cuối cùng 1 mL hỗn hợp EDC, MIA đƣợc đổ vào ống
Tinh thể
Tinh thể 6
27
nghiệm lắc đều nhẹ tay và để qua đêm cho phản ứng hoàn toàn xảy ra.
Sau đó dung dịch đƣợc lọc rửa lại bằng quay li tâm, mỗi lần rửa đều sử dụng chế độ 2000 rpm trong vòng 30 phút. Lưu ý, tất cả dung môi sử dụng để quay li tâm đều là PBS 1X được pha bằng nước cất 2 lần khử trùng. Cuối cùng dd chứa hệ hạt ZnS-4ATP-ARN được pha ra 10 mL dung dịch và lưu trong tủ 4oC. Mỗi lần sử dụng đều đƣợc hút 0,5 mL bằng đầu côn khử trùng.
Các mẫu chứa hệ hạt ZnS-4ATP-ARN2 đƣợc tiến hành đo phổ tán xạ Raman để khẳng định sự liên kết của hạt Zn-4ATP với ARN2.
2.2.2. Khảo sát khả năng ứng dụng của vật liệu nano ZnS vào cảm biến điện hóa để xác định nồng độ ADN của virus EBV
Hình 2.2. Nguyên lý hoạt động của cảm biến ADN sử dụng hạt nano ZnS- 4ATP để phát hiện sự có mặt ADN của virus.
Hình 2.2 mô tả nguyên lý hoạt động của cảm biển, cảm biến ADN sử dụng hai loại ARN khác nhau có khả năng bắt cặp đặc hiệu với ADN của virus Estenbar (EBV). Khi có xự xuất hiện của ADN đích (ADN của virus EBV), chuỗi ARN1 gắn với điện cực vàng và chuỗi ARN2 gắn với hạt nano ZnS sẽ bắt cặp với chuỗi ADN đích tạo thành hệ sandwich “điện cực - 4ATP – ARN1 – ADN đích – ARN2 – 4ATP – ZnS” (Sau đây gọi là hệ “điện cực – ADN – ZnS”). Khi nồng độ ADN thay đổi sẽ kéo theo sự thay đổi về số lƣợng bắt cặp của hệ “điện cực – ADN – ZnS”. Áp dụng phương pháp đo điện thế quét vòng trên bề mặt điện cực có thể xác định được nồng độ ADN của virus EBV có trong dung dịch.
Điện cực sử dụng là điện cực vàng đƣợc thiết kế nhƣ sau:
ARN1 ARN2
28
Hình 2.3. Thiết kế của điện cực vàng sử dụng trong cảm biến ADN
Mỗi lần sử dụng, bề mặt điện cực đƣợc mài bằng giấy nhám 8000 (8000 hạt/mm2). Sau đó điện cực được rửa siêu âm trong nước cất 2 lần trong 30 phút, rồi tiếp tục lần lượt siêu âm trong H2SO4 0,5 M và NaOH 0,1 M. Cuối cùng nước cất 2 lần đƣợc sử dụng để loại bỏ các hóa chất còn dƣ [45].
Để chức năng hóa, điện cực đƣợc ngâm trong 10 mL dung dịch 4-ATP 0,1M (4-ATP đƣợc pha bằng ethanol), thời gian 12h. Khi này, các phân tử 4-ATP sẽ liên kết với bề mặt điện cực thông qua liên kết Au-S bền vững [23]; đầu còn lại là các nhóm –NH2 tự do. Lưu ý, là từ sau bước chức năng hóa với 4-ATP điện cực đều đƣợc ngâm rửa với dung dịch đệm PBS 1X đã đƣợc khử trùng, đảm bảo không lẫn các tạp phân tử sinh học lạ.
Để khảo sát nồng độ ADN thông qua điện thế quét vòng, ADN đích có trong dung dịch đã được đun sôi trong 5 phút sau đó nhanh chóng đưa vào trong nước đá để giải phóng các chủng ADN nhƣng vẫn còn ở dạng mạch đơn.
Nồng độ ADN đích khác nhau (Bảng 2.6) đƣợc thêm vào trong dung dịch đệm PBS có chứa ZnS-4ATP-ARN2, điện cực gắn với ARN1 cũng đƣợc đƣa vào cùng lúc. Hệ mẫu đƣợc để phản ứng trong 10 phút sau đó điện cực sẽ đƣợc rửa sạch 3 lần bằng PBS.
Mẫu a b c d e
Nồng độ AND đích (coppies/ml)
0,5 × 105 1,0 × 105 1,5 × 105 2,0 × 105 1,5 ×105 Bảng 2.6. Nồng độ ADN đích nhỏ vào điện cực trong quá trình khảo sát Điện cực sau đó được khảo sát bằng phương pháp đo điện thế quét vòng trong khoảng [- 0,2 V, 0,6 V].
Dây Cu Trụ vàng Au
29