3.2.1. Đánh giá khả năng liên kết đặc hiệu của các phân tử ZnS-4ATP với ARN2.
Với mục đích ứng dụng hạt nano ZnS trong cảm biến ADN nhằm phát hiện virus gây bệnh, các hạt ZnS-4ATP đã đƣợc đính kết với các phân tử ARN2 – là một chuỗi các nucleotide có khả năng nhận biết đặc hiệu ARN của virus EBV – tác nhân gây ung thƣ vòm họng, ung thƣ hạch bạch huyết và ung thƣ dạ dày.
Để khảo sát khả năng gắn kết giữa hạt nano ZnS-4ATP với các phân tử ARN, nhóm nghiên cứu tiến hành đo phổ Raman nhƣ Hình 3.15, trong đó nhóm đã tiến hành đo với 2 loạt mẫu: mẫu ZnS-4ATP và mẫu ZnS-4ATP-ARN.
Trong số các đỉnh phổ thu đƣợc, ta có thể thấy một số đỉnh biểu diễn các dao động phonon đặc trƣng của tinh thể ZnS nhƣ các đỉnh tại vị trí 259 cm-1 và 348 cm-1 tương ứng với các dao động phonon dọc và ngang [18]; đỉnh tại vị trí 307 cm-1 trùng với đỉnh tán xạ Raman loại 2 của tinh thể ZnS [15]. Trong khoảng từ 1000 cm-1 đến 1800 cm-1, phổ tán xạ có các đỉnh đặc trƣng cho dao động của các phân tử 4-ATP, đƣợc tổng hợp trong Bảng 3.3. Từ 370 cm-1 to 900 cm-1 phổ tán xạ còn có thêm đỉnh tại các vị trí 438 cm-1, 514 cm-1, 579 cm-1, 683 cm-1, 766 cm-1 ADN 863 cm-1. Sự xuất hiện các đỉnh này có thể là do những dao động mạnh của các phân tử hữu cơ 4-ATP.
42
Hình 3.15. Phổ Raman của các hạt ZnS-ATP (a), ZnS-4ATP sau khi gắn với các phân tử ARN nhận biết EBV (b) và sự khác biệt giữa hai phổ [(b)-(a)]. Kết quả cho
thấy sự có mặt của các đỉnh phổ đặc trưng cho các liên kết của chuỗi ARN/ADN cùng với các hạt vật liệu.
Đo đƣợc (cm-1)
Đã công bố
(cm-1) Dao động Tham khảo
259 259 TO (ZnS) hoặc ν ZnS [18]
307 304 Second order W (ZnS) [15]
348 347 LO (ZnS) [18]
387 389 νCS+δNH+γ’ [16]
1018 1002 γCC+γCCC+νCS [16]
1188 1178 δCH [16]
1305 1294 νCN [16]
1409 1386 νCN+ γPhenyl [16]
1487 1484 γPhenyl +δNH [16]
Bảng 3.2. Các đỉnh phổ nhiễu xạ Raman của các hạt ZnS-ATP và ZnS-4ATP-ARN Do nồng độ ARN thấp, các đỉnh phổ đo đƣợc do các dao động và liên kết của phân tử ARN thấp hơn nhiều so với các phân tử 4-ATP. Để biểu thị sự khác nhau giữa hai phổ, chúng tôi đã tiến hành nhân phổ của ZnS-4ATP để sao cho phổ của
ZnS-4ATP-ARN ZnS-4ATP
43
ZnS-4ATP gần trùng nhất với phổ ZnS-4ATP-ARN, sau đó trừ hai phổ cho nhau để thu đƣợc phổ mới – đƣợc gọi tên là phổ hiệu ((b) - (a)).
Phổ hiệu đã chỉ ra sự có mặt của chuỗi ADN đơn lẻ. Có thể thấy phổ hiệu có sự xuất hiện thêm một số đỉnh phổ tại 1082 cm-1, 1252 cm-1, 1474 cm-1, 1643 cm-1 và 1748 cm-1 lần lƣợt ứng với các liên kết đặc hiệu khung ribose, vòng thơm của Thymine, -NC- của Thymine, C=O-CN- của Cytosine và –C-P(OH)2N- của chuỗi nucleotide khớp với các đỉnh phổ đã công bố, đƣợc liệt kê trong Bảng 3.3. Bên cạnh đó có 2 đỉnh phổ ở vị trí 1354 cm-1 và 1748 cm-1, sự xuất hiện của hai đỉnh này có thể đƣợc tạo nên từ dao động của nhóm (–N-P(OH)2-C-) hình thành từ phản ứng giữa nhóm (–NH2) của 4-ATP với các nhóm phosphate của ARN.
Đo đƣợc (cm-1)
Đã công bố
(cm-1) Dao động Tham khảo
1082 1093 DNA backbone [38]
1252 1238 Vòng + CH of Thymine [33]
1354 -C3-P(OH)2-N- Nghiên cứu
này
1474 1472
1482
-N1C2+C2N3 của Thymine
N3C4 +N3C4 củaCytosine [33]
1643 1655
1657
C2=O-C2N3 của Cytosine
C4=O+C-C6 của Thymine [33]
1748 -C3-P(OH)2-N- Nghiên cứu
này Bảng 3.3. Các đỉnh phổ nhiễu xạ Raman thu được từ phổ hiệu
Nhƣ vậy, có thể khẳng định các hạt nano ZnS-4ATP đã liên kết thành công với các phân tử ARN.
3.2.2. Đánh giá khả năng ứng dụng của hạt nano ZnS trong cảm biến điện hóa để phát hiện nồng độ ADN của virus EBV.
Các chuỗi ADN đích liên kết với các hạt ZnS-4ATP-ARN2 và với hệ điện cực – ARN1 tạo thành một hệ thức sandwich phức: “điện cực – ADN – ZnS”. Khi thay đổi nồng độ của ADN đích, quá trình lai tạo “điện cực – ADN – ZnS” tăng lên do đó làm tăng số lƣợng hạt ZnS trên bề mặt điện cực. Khi điện thế quét vòng áp dụng trong khoảng [-0,2V: 0,6V], một số các nguyên tố Zn từ tinh thể bỏ điện tử và
44
trở thành các ion dương, thể hiện trong phương trình sau:
( 1) 2
)
( 2 ( )
)
(ZnS ncrystal e ZnS n crystal S Zn
Quá trình oxy hóa lớn nhất tại đỉnh oxy hóaE(Zn/Zn2)= 0,34 V, tương ứng với các đỉnh quan sát đƣợc trong hình 3.16.
Hình 3.16. Điện thế quét vòng với các nồng độ ADN khác nhau
Hình 3.16 mô tả sự phụ thuộc của dòng điện thay đổi trên bề mặt điện cực vào điện thế trong phương pháp đo điện thế quét vòng khi nồng độ ADN đích khác nhau.
Nhƣ đã thảo luận, khi tăng nồng độ ADN đích, số lƣợng các hạt ZnS có trên bề mặt điện cực tăng theo và do đó, quá trình oxy hóa diễn ra trên bề mặt điện cực cũng tăng lên. Hình 3.16 cho thấy sự thay đổi của dòng điện đo đƣợc tại vị trí 0,34V – vị trí oxy hóa khử của Zn2+, nồng độ ADN đích càng lớn thì sự thay đổi càng rõ rệt. Khi nồng độ ADN đích giảm xuống còn 0,5×105 các tín hiệu gần nhƣ không phân biệt đƣợc với nhau.
Tuy nhiên khi lập một đường tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ dòng vào nồng độ ADN tại vị trí 0,34 V, thể hiện trong Hình 3.17, ta có thể thấy rằng độ nhạy đạt đƣợc là cỡ 0,12 μA/mm2fM.
Mật độ dòng điện đƣợc tính toán theo công thức:
Dòng CE (μA)
Điện thế (V)
Tăng nồng độ ADN đích
45 I
S
Trong đó: là mật độ dòng điện (A/m2); I là cường độ dòng (A); S tiết diện điện cực vàng đường kính 3 mm
Và nồng độ ADN đƣợc tính bằng số phân tử ADN chia cho hằng số Avogadro:
( )
M ADN A
C N
N
Trong đó CM(ADN) là nồng độ mol của ADN (M), N là số các phân tử ADN có trong dung dịch, NA là hằng số Avogadro, NA = 6,022. 1023 mol−1.
Hình 3.17. Sự phụ thuộc của mật độ dòng điện trong điện cực vào nồng độ ADN đích.
Như vậy, hạt nano ZnS-4ATP chế tạo được đã bước đầu ứng dụng thành công trong cảm biến ADN để phát hiện nồng độ ADN của virus gây bệnh.
Mật độ dòng (μA/mm2 )
Nồng độ ADN (fM) Mật độ dòng (μM/mm2) Đường fit