3.1.1. Thu mẫu
Việc lấy mẫu được chúng tôi thực hiện tại một số hộ hiện đang còn lưu giữ giống lợn Ỉ thuần chủng trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa. Mẫu máu sẽ đƣợc thu trực tiếp thông qua tĩnh mạch cổ của các cá thể lợn Ỉ khỏe mạnh đƣợc nuôi tại các hộ gia đình trên (hình 3.1). Tổng cộng chúng tôi đã thu đƣợc đủ 30 mẫu máu. Mẫu máu thu đƣợc sau quá trình vận chuyển về Viện Nghiên cứu hệ gen sẽ được bảo quản ở -20oC trước khi tiến hành tách chiết DNA.
Hình 3.1. Hình ảnh các cá thể lợn Ỉ
3.1.2. Tách chiết DNA tổng số
Nhằm mục đích khuếch đại hệ gen ty thể đồng thời có thể lưu giữ bộ gen của giống lợn Ỉ lâu dài,chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số từ toàn bộ số lƣợng mẫu máu thu đƣợc trong quá trình lấy mẫu. Quá trình tách chiết hoàn toàn tuân thủ theo phương pháp đã được mô tả trong phần 2.3.2.
Hình 3.2. DNA tổng số được tách từ mẫu máu lợn Ỉ.
Giếng 1-6 tương ứng với mẫu DNA tổng số của các cá thể lợn Ỉ được đánh số từ 1-6.
Kết quả tách DNA tổng số từ mẫu máu lợn Ỉ đƣợc kiểm tra thông qua kết quả điện di gel Agarose 1% đƣợc thể hiện trong hình 3.2. Kết quả điện di cho thấy, ở tất cả các giếng, băng DNA tổng số đều lên rõ, mẫu đứt gãy không nhiều và không lẫn quá nhiều tạp chất. Tất cả các mẫu DNA tổng số thông qua kiểm tra đều đã đủ chất lƣợng cho các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chỉ sử dụng duy nhất mẫu DNA tổng số của cá thể lợn Ỉ 01 để khuếch đại trình tự ty thể phục vụ quá trình giải trình tự. Toàn bộ số DNA tổng số còn lại sẽ đƣợc cất giữ ở -20oC để sử dụng cho các nghiên cứu tính đồng nhất về di truyền của quần thể sau này hay tìm kiếm các SNP đặc trƣng cho giống lợn Ỉ.
3.1.3. Khuếch đại hệ gen ty thể
Sử dụng 30 cặp mồi đã đƣợc thiết kế và thể hiện nhƣ ở bảng 2.1, chúng tôi tiến hành khuếch đại trình tự toàn bộ hệ gen ty thể bằng PCR để tạo thành 30 đoạn DNA ngắn. Thành phần phản ứng PCR đƣợc mô tả trong bảng 2.2 và chu kỳ nhiệt đƣợc mô tả trong phần phương pháp. Kết quả khuếch đại được kiểm tra trên gel Agarose 1%
(hình 3.3).
Hình 3.3. Sản phẩm PCR khuếch đại tại nhiệt độ gắn mồi 54oC.
Số thứ tự của giếng tương ứng với số thứ tự của mồi được trình bày tại bảng 2.1, (-): Đối chứng âm, M: Marker 1kb
Với mỗi giếng được chạy và đánh số tương ứng với số thứ tự của mồi được sử dụng để thực hiện phản ứng PCR (bảng 2.1). Tại nhiệt độ gắn mồi ban đầu đƣợc lựa
25, 26, 27 cho kết quả đặc hiệu, không xuất hiện băng phụ, lƣợng sản phẩm lớn thể hiện qua độ rõ nét của băng. Tại các giếng 1, 2, 5, 6, 11, 17, 19, 20, mặc dù lƣợng sản phẩm khuêch đại ít nhƣng băng lên đặc hiệu, do đó thông qua việc tăng gấp đôi lƣợng thể tích phản ứng PCR chúng tôi vẫn đảm bảo đƣợc lƣợng DNA cần thiết cho quá trình tinh sạch và giải trình tự. Các giếng 3, 4, 15, 16, 21, 23, 28, 29, 30 không quan sát thấy có sản phẩm PCR đƣợc tiến hành lại phản ứng với nhiệt độ gắn mồi giảm xuống 53oC (hình 3.4 A,B,C) và 51oC (hình 3.4 D), kết quả các mồi đều cho sản phẩm đặc hiệu.
Tiếp tục tiến hành chạy tăng lượng mồi 3, 4, 15, 16. Kiểm tra lại kích thước các băng với kích thước thiết kế cho kết quả giống nhau, do đó các đoạn trình tự khuếch đại đã đảm bảo yêu cầu cho việc giải trình tự.
Hình 3.4. Sản phẩm PCR khuếch đại tại nhiệt độ gắn mồi 53oC và 51oC.
Số thứ tự của giếng tương ứng với số thứ tự của mồi được trình bày tại bảng 2.1, (-): Đối chứng âm, M:Marker. Phản ứng diễn ra với nhiệt độ gắn mồi 53oC (A, B, C), 51oC (D).
(-): Đối chứng âm, M: Marker 1kb
3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Do quá trình giải trình tự yêu cầu đối với mẫu phải có độ tinh sạch cao. Sản phẩm PCR sau khi đủ lượng và thông qua bước kiểm tra độ đặc hiệu được đưa qua kit tinh sạch nhằm loại bỏ các thành phần phản ứng dƣ.
Hình 3.5. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR hệ gen ty thể.
Số thứ tự của giếng tương ứng với số thứ tự của mồi được trình bày tại bảng 2.1,
Kết quả kiểm tra cho thấy, các băng đều rất rõ nét (Hình 3.5). Nhƣ vậy sản phẩm PCR đã đủ độ tinh sạch để tiến hành giải trình tự.
3.1.5. Kiểm tra kết quả giải trình tự
Mẫu đã khuếch đại trong quá trình phản ứng PCR sẽ đƣợc sử dụng làm khuôn và sử dụng chính các cặp mồi khuếch đại để thực hiện phản ứng giải trình tự. Quá trình thực hiện phản ứng và đọc kết quả đƣợc thực hiện tự động bởi hệ thống ABI3500.
Hình 3.6. Ví dụ cho phần kết quả giải trình tự đủ độ tin cậy và được lựa chọn Tín hiệu giải trình tự có cường độ khá cao, không hề xuất hiện các tín hiệu phụ hay các tín hiệu chồng chéo (hình 3.6), nhƣ vậy chất lƣợng đoạn giải trình tự là khá tốt, trình tự thu đƣợc là đáng tin cậy. Các đoạn trình tự sau khi cắt gọt đƣợc ghép nối với phần mềm DNA Dragon nhƣ đã mô tả để thu đƣợc trình tự hoàn chỉnh. Trình tự kết quả giải trình tự và trình tự của toàn bộ hệ gen ty thể lợn Ỉ đƣợc chúng tôi đƣa ra trong phần phụ lục.