Phương pháp này được phát triển bởi Fred Sanger vào khoảng thời gian giữa những năm 1970 [79]. Thay vì sử dụng phản ứng hóa học, Sanger lựa chọn một phương pháp sử dụng tới một dạng cấu trúc thứ ba của gốc đường ribose. Như thể hiện trong hình 1.1, ribose có một nhóm hydroxyl tại cả hai vị trí carbon 2’ và 3’ trong khi deoxyribose chỉ có duy nhất một nhóm hydroxyl tại vị trí carbon 3’. Dạng thứ ba của ribose trong đó loại bỏ hydroxyl tại cả hai vị trí carbon 2’ và 3’. Dạng này đƣợc gọi là dideoxyribose, và bất cứ khi nào một dideoxyribose đƣợc gắn vào một chuỗi polynucleotide, quá trình kéo dài chuỗi đó sẽ bị dừng lại. Nhƣ vậy, sự kết hợp của các dideoxynucleotide riêng biệt sẽ tạo ra các chuỗi có kết thúc có chọn lọc.
Hình 1.1. Cấu trúc của ba loại đường năm carbon ribose, deoxyribose và dideoxyribose [92].
Các nhóm hydroxyl được biểu diễn bằng màu đỏ.
Sanger đã tiến hành thiết lập quy trình trong đó bốn phản ứng đƣợc thực hiện riêng biệt, kết hợp một loại dideoxynucleotide khác nhau cùng với bốn deoxynucleotide, sẽ tạo ra các đoạn có két thúc tại tất cả các vị trí gắn của nhóm dideoxynucleotide nếu tỷ lệ dideoxynucleotide và deoxynucleotide tương ứng được thiết lập đúng.
Sự ra đời của giải trình tự Sanger đã thức đẩy các nghiên cứu giải trình tự DNA nói chung, sự gia tăng của các dữ liệu trình tự trong các nghiên cứu khoa học cũng dẫn đến việc thành lập các kho lưu trữ trình tự DNA đầu tiên bởi Walter Goad tại Phòng thí nghiệm Quốc gia Los Alamos năm 1979. Kho dữ liệu này sau đó trở thành GenBank [61].
Hình 1.2. Sơ đồ phản ứng giải trình tự Sanger [92].
Ở đây, các mồi giải trình tự được gắn phóng xạ và các phản ứng tạo ra các đoạn trình tự bổ sung với khuôn DNA. Các đoạn trình tự được phân tách trên gel polyacrylamide và được chụp
ảnh phóng xạ. Trình tự được xác định nhờ các băng trên gel.
Một trong những phát triển quan trọng nhất trong phương pháp giải trình tự nhằm tạo nên một hệ thống thông lƣợng cao là sự ra đời của các hệ thống giải trình tự sử dụng kết thúc dideoxy gắn huỳnh quang. Năm 1986, Leroy Hood và các đồng nghiệp đã đưa ra một phương pháp giải trình tự DNA trong đó các tín hiệu phóng xạ đƣợc thay thế bằng tín hiệu huỳnh quang, sử dụng laser cảm ứng huỳnh quang liên kết với hệ thống máy tính [83]. Trong phương pháp của họ, mồi sẽ được gắn một trong bốn loại tín hiệu huỳnh quang khác nhau và đƣợc đƣa vào các phản ứng giải trình tự riêng biệt cùng với một trong bốn loại dideoxynucleotides. Khi phản ứng đã hoàn tất, bốn phản ứng đƣợc gộp lại và chạy cùng nhau trong một làn của gel giải trình tự polyacrylamide. Một cảm biến laser bốn màu sẽ quét qua các đoạn di chuyển trong gel.
Tín hiệu huỳnh quang của từng đoạn sau đó đƣợc gửi tới một máy tính với phần mềm
được thiết kế để nhận diện các base (hình 1.2). Phương pháp này được thương mại hóa vào năm 1987 bởi Applied Biosystems.
Hình 1.3. Cấu trúc và phổ phát xạ huỳnh quang của bốn loại dye succinylfluorescein được phát triển bởi DuPont [92].
A. Cấu trúc của bốn loại dye succinylfluorescein. B. Phổ phát xạ huỳnh quang của các loại dye tại bước sóng kích thích 480 nm .
James M. Prober và các đồng nghiệp tại DuPont đã thực hiện bước phát triển tiếp theo của phương pháp giải trình tự gắn huỳnh quang. Trong đó thay vì gắn huỳnh quang vào mồi, họ gắn tín hiệu vào chính các kết thúc dideoxy. Một bộ dye sẽ bao gồm các succinylfluorescein, thay đổi bước sóng phản xạ thông qua các nhóm phụ khác nhau. Các dye SF505, SF512, SF519, và SF526 đƣợc gắn lần lƣợt vào ddG, ddA, ddC, và ddT. Phổ phát xạ của bốn loại thuốc nhuộm đƣợc thể hiện trong hình 1.3. Tất cả bốn loại dye đều được kích thích bằng laser bước sóng 480 nm và mỗi loại sẽ phát ra một tín hiệu khác nhau đƣợc phát hiện bởi hệ thống cảm biến. Với hệ thống phát hiện này, phản ứng giải trình tự có thể đƣợc thực hiện trong một ống duy nhất với tất cả bốn loại ddNTP và quá trình đọc trình tự đƣợc thực hiện chỉ trong một làn duy nhất [67].
DuPont thương mãi hóa công nghệ của chính mình trong một thời gian ngắn và sau đó bán cho Applied Biosystems.
Hình 1.4. Sơ đò biểu diễn của một hệ thống giải trình tự DNA mao quản [92]. A. Các thiết lập cơ bản của một hệ thống mao quản. Phản ứng giải trình tự được chứa trong ngăn chứa mẫu, đệm điện di được chứa trong ngăn thứ hai, mao quản được bơm đầy polymer, một điện thế được đưa vào hai đầu mao quản. B. Tín hiệu phát ra từ các đoạn giải trình tự khi đi qua laser quét được thu nhận thông qua các cảm biến sáng và thông tin sẽ được chuyền về
máy tính. C. Biểu đồ tín hiệu đầu ra.
Vào những năm 1990, Applied Biosystems đã tiếp tục có những sự tinh chỉnh đối với các hóa chất và thiết bị cảm biến. Các thuốc nhuộm huỳnh quang đã đƣợc thay đổi thành một loạt các dẫn xuất của rhodamine, ddG, ddA, ddC, và ddT lần lƣợt đƣợc gắn với dichloroROX, dichloroR6G, dichloroR110 và dichloroTAMRA. Mặc dù những cải thiện này dẫn đến tăng đáng kể hiệu suất giải trình tự DNA, hệ thống vẫn
phải sử dụng gel acrylamide vốn cần quá nhiều thao tác và không phù hợp với một hệ thống thông lƣợng cao. Đến những năm 1990, Harold Swerdlow và các đồng nghiệp đã sử dụng điện di mao quản trong giải trình DNA [88, 89]. Mao quản có kích thước nhỏ, đường kính bên trong chỉ 50μm, chúng có khả năng tản nhiệt rất hiệu quả do diện tích bề mặt lớn. Điều này có nghĩa rằng hệ thống mao quản có thể chạy với điện áp cao hơn nhiều từ đó giảm đáng kể thời gian chạy. Quan trọng nhất, các hệ thống mao quản có thể chạy tự động, ƣu điểm lớn so với hệ thống dựa trên gel. Cuối cùng vào năm 1993, B.L. Karger và các đồng nghiệp báo cáo về việc sử dụng một loại chất nền phân tách độ nhớt thấp có thể bơm vào các mao quản với áp suất tương đối thấp [74]. Loại polyme này có thể rửa ra và thay thế sau quá trình sử dụng. Đây là tất cả các yếu tố cần thiết để phát triển một nền tảng giải trình tự thông lƣợng cao (hình 1.4). Hiện nay hệ thống đƣợc phát triển có thể giải trình tự các đoạn DNA có độ dài 500-1000 base chỉ trong vài giờ.