3.2. Phân tích hệ gen ty thể lợn Ỉ
3.2.1. Dự đoán gen ty thể
Hệ gen ty thể của lợn Ỉ có kích thước 16,731 base pairs (bp) (hình 3.7). Phân tích thành phân nucleotide đối với tỷ lệ A, C, G, T lần lƣợt là 34,66%, 26,24%, 13,35%, 25,75%, phần trăm AT chiếm 60,41%.
Hình 3.7. Cấu trúc dạng vòng của hệ gen ty thể lợn Ỉ được xây dựng bởi phần mềm GenomeVX.
Dựa trên cấu trúc hệ gen ty thể đã dự đoán và xây dựng đƣợc (bảng 3.1). Hệ gen ty thể lợn Ỉ bào gồm 2 gen mã hóa RNA ribosome, 13 gen mã hóa protein, 22 gen mã hóa RNA vận chuyển và một vùng kiểm soát D loop, phân bố trên cả hai sợi nặng và nhẹ của ty thể. Vùng D loop có độ dài 1,295 bp và nằm giữa hai gen mã hóa tRNA Phe và tRNA Pro. Ngoài ra còn có mười hai vùng không mã hóa nhỏ nằm rải rác trên khắp hệ gen ty thể với độ dài từ 1 đến 32 bp và tám vùng mà các trình tự gen nằm gối lên nhau từ 1 đến 43 bp. Độ dài các gen rRNA 12S và 16S lần lƣợt là 960 và 1,570 bp. Hai
bp, trong đó có hai tRNA Ser (anti-codon GCT và TGA) và hai tRNA Leu (anti-codon TAA và TAG), 14 gen nằm trên sợi nặng và tám gen nằm trên sợi nhẹ của hệ gen ty thể. Tổng độ dài của mười ba gen mã hóa cho protein là 11,413 bp với độ dài các gen nằm trong khoảng từ 204 đến 1,821 bp, trong đó gen có kích thước dài nhất là ND5, gen có kích thước ngắn nhất là ATPase8. Trong số mười ba gen mã hóa cho protein, ngoại trừ gen ND4l có mã bộ ba khởi đầu là GTG, các gen con lại có mã khởi đầu là ATG (COX1, COX2, COX3, ATPase6, ATPase8, ND1, ND4, ND6, Cytb) hoặc ATA (ND2, ND3, ND5). Mã kết thúc của các gen này đều là TAG hoặc TAA trừ gen Cytb mang mã bộ ba kết thúc là AGA, bên cạnh đó có bốn gen (COX2, COX3, ND3 và ND4) mang bộ ba kết thúc không hoàn chỉnh T--, mà theo giả định sẽ hình thành một bộ ba kết thúc TAA sau khi trải qua quá trình gắn đuôi poly A trong quá trình biến đổi hậu phiên mã.
Bảng 3.1. Cấu trúc của hệ gen ty thể lợn Ỉ
Gen
Codon
Chuỗi GC skew
AT skew
Vị trí Kích
thước (bp)
Khoản g cách
(bp) Khởi
đầu
Kết thúc
Anti-
codon Khởi đầu Kết thúc
D-loop H 1 1295 1295 0
tRNA Phe GAA H 1296 1365 70 0
12S rRNA H -0.15 0.25 1366 2325 960 0
tRNA Val TAC H 2327 2394 68 1
16S rRNA H -0.11 0.24 2395 3964 1570 0
tRNA
Leu2 TAA H 3965 4039 75 0
ND1 ATG TAG H -0.40 0.13 4042 4998 957 2
tRNA Ile GAT H 4997 5065 69 -2
tRNA Gln TTG L 5063 5135 73 -3
tRNA Met CAT H 5137 5206 70 1
ND2 ATA TAG H -0.49 0.24 5207 6250 1044 0
tRNA Trp TCA H 6249 6316 68 -2
tRNA Ala TGC L 6323 6390 68 6
tRNA Asn GTT L 6392 6466 75 1
Bảng 3.1. Cấu trúc của hệ gen ty thể lợn Ỉ (tiếp)
Gen
Codon
Chuỗi GC skew
AT skew
Vị trí Kích
thước (bp)
Khoản g cách
(bp) Khởi
đầu
Kết thúc
Anti-
codon Khởi đầu Kết thúc
tRNA Cys GCA L 6499 6564 66 32
tRNA Tyr GTA L 6565 6629 65 0
COX1 ATG TAA H -0.20 0.00 6631 8175 1545 1
tRNA
Ser2 TGA L 8179 8247 69 3
tRNA Asp GTC H 8255 8322 68 7
COX2 ATG T-- H -0.31 0.12 8323 9010 688 0
tRNA Lys TTT H 9011 9077 67 0
ATPase8 ATG TAA H -0.55 0.20 9079 9282 204 1
ATPase6 ATG TAA H -0.46 0.11 9240 9920 681 -43
COX3 ATG T-- H -0.32 0.05 9920 10703 784 -1
tRNA Gly TCC H 10704 10772 69 0
ND3 ATA T-- H -0.47 0.16 10773 11118 346 0
tRNA Arg TCG H 11120 11188 69 1
ND4l GTG TAA H -0.32 0.01 11189 11485 297 0
ND4 ATG T-- H -0.49 0.14 11479 12856 1378 -7
tRNA His GTG H 12857 12925 69 0
tRNA
Ser1 GCT H 12926 12984 59 0
tRNA
Leu1 TAG H 12985 13054 70 0
ND5 ATA TAA H -0.46 0.15 13055 14875 1821 0
ND6 ATG TAA L 0.56 -0.35 14859 15386 528 -17
tRNA Glu TTC L 15387 15455 69 0
Cytb ATG AGA H -0.38 0.09 15460 16599 1140 4
tRNA Thr TGT H 16600 16667 68 0
tRNA Pro TGG L 16667 16731 65 -1
Giống như các nghiên cứu trước đó về hệ gen ty thể lợn. Trong nghiên cứu này
thông tin cơ bản nhất: độ dài hệ gen ty thể, thành phần nucleotide của trình tự, vị trí và độ dài các gen, mã bộ ba khởi đầu và kết thúc cho các gen mã hóa cho protein và bộ ba đối mã cho các gen mã hóa cho các RNA vận chuyển, những kết quả này là tương đồng với các giống lợn khác [81, 102]. Bên cạnh đó là các thông số GC skew và AT skew.
Các chỉ số GC và AT skew đại diện cho mức độ lệch trong tỉ lệ thành phần nucleotide của trình tự hệ gen ty thể. Các chỉ số này xuất phát từ giả thiết về sự thay thế không cân bằng giữa hai sợi DNA [85]. Giả thiết đƣa ra điều kiện để thành phần giữa hai sợi là cân bằng là không có bất cứ đột biến hoặc sự chọn lọc nào xảy ra. Dưới điều kiện đó, tần số các thành phần trong trình tự của một sợi sẽ là bằng nhau (A=T=C=G). Và bất kỳ những sai lệch đối với mối quan hệ A=T hoặc G=C đều cho thấy sự bất đối xứng trong việc thay thế các thành phần (các đột biến và chọn lọc) [53, 85]. Những biến đổi đổi này đƣợc thể hiện thông qua giá trị của hai chỉ số GC skew hoặc AT skew, các chỉ số này đã từng được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây nghiên cứu về sự thay đổi về thành phần nucleotide của ty thể và kết quả cho thấy chúng có mối liên hệ với sự chủng loại phát sinh [34, 96].
Hầu hết các gen mã hóa protein và rRNA đều nằm trên sợi nặng, các gen này có giá trị GC skew mang giá trị âm và AT skew mang giá trị dương, điều này thể hiện thành phần Cytosine và Adenine trên cùng một sợi là nhiều hơn so với Guanine và Thymine, gen có giá trị GC skew thấp nhất là ATPase8 (-0.55) và gen có GC skew cao nhất là rRNA 16S (-0.11) , rRNA 12S có AT skew là 0.25 là gen có mức độ lệch giữa A và T cao nhất và COX1 có tỉ lệ A và T là bằng nhau (AT skew = 0). Trên sợi nhẹ, chỉ có duy nhất một gen mã hóa cho protein là ND6 có GC skew dương (0.56) và AT skew âm (-0.35) tức là ngƣợc lại so với các gen trên sợi nặng.
Kết quả tính toán GC skew và AT skew của các gen cho thấy tất cả các gen ngoại trừ gen COX1 có AT skew = 0, đều có sự thiên lệch nhất định trong thành phần nucleotide. Điều này có thể xuất phát từ quá trình tích lũy các đột biến và chọn lọc trong quá trình chủng loại phát sinh. Để có thể tìm ra mối quan hệ chủng loại phát sinh
đó, chúng tôi đã tiến hành các so sánh các thông số này giữa giống lợn Ỉ với các giống lợn khác nhau. Do không thể so sánh từng gen riêng lẻ của các giống lợn với nhau đƣợc, chúng tôi quyết định chọn hai vùng trình tự của đoạn D loop và trình tự hoàn chỉnh, bởi chúng vừa có tính bao quát, đồng thời cũng là các đối tƣợng mà chúng tôi sẽ sử dụng để xây dựng cây chủng loại phát sinh sau đó.
Bởi motif lặp lại liên tiếp “CGTGCGTACA” có thể gây ra hiện tƣợng heteroplasmy ảnh hưởng tới kết quả phân tích [27]. Do đó, trước khi tiến hành phân tích chúng tôi đã loại bỏ motif này khỏi trình tự hệ gen ty thể lợn Ỉ và cả các trình tự đã công bố của các giống lợn khác đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. Thành phần nucleotide của trinh tự ty thể của lợn Ỉ sau khi loại bỏ motif có sự thay đổi. Tỷ lệ phần trăm A, C, T, G lần lƣợt là 34,83%, 26,19%, 13,15%, and 25,82%.
Để tìm kiếm sự khác biệt về thành phần trình tự đối với giống lợn Ỉ. Các chỉ số đặc trƣng cho trình tự là % AT, GC skew và AT skew đƣợc so sánh giữa trình tự của lợn Ỉ và các giống lợn khác. Giá trị của các chỉ số % AT, GC skew và AT skew của trình tự hoàn chỉnh của lợn Ỉ lần lƣợt là 60,65 ; -0.33, 0.15; các chỉ số của trình tự D loop lần lƣợt là 60,09 ; -0.32, 0.16. Khoảng gíá trị của các chỉ số phần trăm AT, GC skew và AT skew của các trình tự hoàn trình đã công bố lần lƣợt là (60,19; 60,82), ( - 0.34; -0.30) và (0.12; 0.15). Khoảng gíá trị của các giá trị phần trăm AT, GC skew và AT skew cùa các trình tự D loop đã công bố lần lƣợt là (60,73; 61,80), (-0.38; -0.31);
(0.15; 0.19). Nhìn một cách tổng quát có thể thấy các chỉ số GC skew đều mang giá trị âm, các AT skew đều mang giá trị dương ở cả hai vùng trình tự. Như vậy xu hướng thay đổi thành phần nucleotide tại các vùng trình tự và giữa các giống lợn là không khác biệt. Đồng thời nếu so sánh các chỉ số giữa hai vùng trình tự D loop và trình tự hoàn chỉnh, có thể thấy vùng D loop ở đa phần các giống lợn đều AT hơn và có mức độ biến đổi thành phần nucleotide cao hơn so với trình tự toàn bộ hệ gen ty thể. Tuy nhiên, so sánh cho thấy vùng trình tự D loop của lợn Ỉ lại có hàm lƣợng AT ít hơn so
loop cũng thấp hơn khi so sánh với trình tự hoàn chỉnh của chính giống này. So sánh giữa lợn Ỉ với các giống lợn khác, phần trăm AT vùng D loop của lợn Ỉ (60,09%) thấp hơn so với các trình tự khác, phần trăm AT của trình tự hoàn chỉnh (60,65%) cũng chỉ lớn hơn một chút so với lợn Bihu (60.19%). Vùng D loop của lợn Ỉ cũng ít có sự biến đổi GC hơn hầu hết các giống lợn khác, ngoại trừ lợn hoang Yunnan (-0.31) (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Khu vực địa lý và các thông số thành phần trình tự của các giống lợn
Vùng địa lý Tên trình tự Genbank ID
Trình tự hoàn chỉnh Trình tự D loop
%AT GC
skew
AT
skew %AT GC
skew
AT skew I-Vietnam KX094894 60.65 -0.33 0.15 60.09 -0.32 0.16
Đông Bắc Á
Jeju AY879785.1 - - - 61.45 -0.35 0.17
Korean native
pig AY879794.1 - - - 61.24 -0.35 0.15
WB-China
northeast EU333163.1 60.75 -0.33 0.15 61.80 -0.34 0.15
WB-Japan AB015085.1 - - - 60.91 -0.33 0.16
WB-Korea AY574047.1 60.81 -0.33 0.15 61.41 -0.33 0.16 Khu vực
sông Hoàng Hà
Bamei EF545583.1 60.79 -0.33 0.15 61.31 -0.34 0.16 Huzu EF545588.1 60.80 -0.33 0.15 61.31 -0.34 0.16
Khu vực các nước châu
Âu
Berkshire AY574045.1 60.72 -0.33 0.15 61.53 -0.34 0.16 Duroc AY337045.1 60.68 -0.33 0.15 61.34 -0.35 0.16 Hampshire AY574046.1 60.67 -0.33 0.15 61.73 -0.36 0.16 Iberian FJ236994.1 60.71 -0.34 0.15 61.63 -0.35 0.16 Landrace AF034253.1 60.72 -0.33 0.15 61.53 -0.35 0.15 Large White KC250275 60.73 -0.33 0.15 61.53 -0.35 0.16 Pietrain KC469587 60.72 -0.34 0.15 61.48 -0.35 0.16 WB-European FJ237000.1 60.72 -0.34 0.15 61.44 -0.35 0.17
- : Trình tự hoàn chỉnh chƣa đƣợc công bố.
Bảng 3.2. Khu vực địa lý và các thông số thành phần trình tự của các giống lợn (tiếp)
Vùng địa lý Tên trình tự Genbank ID
Trình tự hoàn chỉnh Trình tự D loop
%AT GC
skew
AT
skew %AT GC
skew
AT skew
Khu vực Mekong
Banna mini GQ220328.1 60.72 -0.33 0.15 60.84 -0.34 0.16 Dahe GQ220329.1 60.76 -0.33 0.15 61.08 -0.33 0.16 Thailand
indigenous pig FM244493.1 - - - 61.30 -0.33 0.16
WB-Malaysia EF545592.1 60.82 -0.33 0.15 61.41 -0.38 0.19 WB-Vietnam EF545584.1 60.74 -0.33 0.15 61.31 -0.34 0.16 WB-Yunnan EF545573.1 60.72 -0.33 0.15 60.73 -0.31 0.15 Khu vực
Nam Trung Quốc
Lantang KC250274 60.78 -0.33 0.15 61.43 -0.34 0.16 Lanyu DQ518915.2 60.75 -0.30 0.12 61.45 -0.34 0.16 WB-Fujian EF545569.1 60.81 -0.33 0.15 61.29 -0.33 0.16 WB-Hainan EF545572.1 60.81 -0.33 0.15 61.32 -0.33 0.15
Khu vực sông Trường
Giang
Aba EF545578.1 60.79 -0.33 0.15 61.31 -0.34 0.16 Bihu EF545591.1 60.19 -0.31 0.14 61.31 -0.34 0.16 Jinhua KC469586 60.78 -0.33 0.15 61.54 -0.34 0.16
Kele EF536857.1 - - - 61.32 -0.34 0.16
Taoyuan AM040653.1 - - - 61.34 -0.34 0.16
WB-Jiangxi EF545579.1 60.78 -0.33 0.15 61.41 -0.34 0.16 Wei EF545577.1 60.80 -0.33 0.15 61.31 -0.34 0.16 Xiang pig KC250273 60.82 -0.33 0.15 61.41 -0.33 0.16
Mặc dù dấu của giá trị AT skew và GC skew đại diện cho xu hướng lệch của thành phân nucleotide tương ứng, nhưng do các giá trị AT skew của các giống lợn đều đồng thời nhận giá trị dương và và GC skew đều nhận giá trị âm. Trong các phân tích tiếp sau đây, chúng tôi sẽ so sánh đến mức độ biến đổi GC hay AT đƣợc thể hiện qua giá trị tuyệt đối của các giá trị GC skew và AT skew tương ứng. Kết quả so sánh các chỉ số đối với tất cả các giống khác chúng tôi cũng tìm ra một số khác biệt đáng chú ý nhƣ:
Đối với trình tự hoàn chỉnh, Lanyu là giống lợn ít có sự biến đổi về thành phần GC nhất (0.30) và giống lợn này cũng có độ lệch giữa hai loại nucleotide Adenine và Thymine là thấp nhất (0.12). Ngƣợc lại giống lợn có mức độ khác biệt giữa Cytosine và Guanine trên trình tự hoàn chỉnh cao nhất (-0.34) là các giống Iberian, Pietrain, WB-European cũng đồng thời có chỉ số AT skew của trình tự hoàn chỉnh là cao nhất (0.15) khi so sánh giữa các trình tự hoàn chỉnh với nhau.
Đối với trình tự D loop, chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự như vậy.
Giống có trình tự D loop ít có sự chênh lệch nhất giữa Cytosine và Guanine là WB- Yunnan (0.31) cũng đồng thời có độ lệch giữa Adenine và Thymine thấp nhất (0.15).
Giống lợn có giá trị tuyệt đối cao nhất trên cả hai chỉ số là WB-Malaysia (GC skew=0.38, AT skew=0.19).
Kết quả này cho thấy rằng các giá trị tuyệt đối của các chỉ số AT skew và GC skew ở cùng một loài có thể có sự liên kết với nhau, giống có độ biến đổi GC cao thì mức độ AT cũng sẽ cao. Chúng tôi nhận thấy rằng kết quả này là không hề mâu thuẫn với giả thiết về sự thay thế không cân bằng giữa hai sợi DNA [85] và mối liên quan của những chỉ số này tới mối quan hệ chủng loại phát sinh [34, 85, 96]. Tuy nhiên, mức độ khác biệt giữa các chỉ số này lại không đủ độ lớn, có quá nhiều các giống các giá trị bằng nhau. Do đó mặc dù đã chỉ ra một số sự khác biệt của lợn Ỉ so với các giống lợn khác mà rõ ràng nhất là ở vùng D loop với phần trăm AT và mức độ lệch của GC thấp ở trên, rất khó để có thể xác định đƣợc mối quan hệ chủng loại phát sinh dựa trên các thông số này.
Tất cả các phân tích trên đều dựa trên kết quả dự đoán gen đƣợc thực hiện trên các công cụ MITOS và DOGMA. Các công cụ này sẽ dựa trên ngân hàng dữ liệu có sẵn để tìm ra các vùng gen có sự tương đồng, từ đó dự đoán ra vị trí của các gen này trên trình tự. Bên cạnh đó, MITOS còn đƣa ra cấu trúc bậc hai của các tRNA dựa trên vùng gen dự đoán đƣợc. Kết quả dự đoán cấu trúc bậc hai cho thấy, cấu trúc của hai mươi mốt tRNA ngoại trừ tRNA Ser-1 đều có dạng cỏ ba lá điển hình được tạo thành
từ ba thùy DHU, TψC và anti-codon (hình 3.8). tRNA Ser-1 do có kích thước gen ngắn, chỉ có 59 bp, do đó có phần thùy dihydrouridine (DHU) không hình thành đƣợc cấu trúc bền vững.
Hình 3.8. Cấu trúc bậc hai của 22 loại tRNA được mã hóa trên hệ gen ty thể lợn Ỉ.
Kết quả dự đoán cấu trúc bậc hai tRNA mặc dù chƣa đƣợc sử dụng để so sánh phân tích trong nghiên cứu này tuy nhiên đây vẫn là nguồn dữ liệu hữu hiệu cho việc phân tích trong những nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2. Kết quả so sánh trình tự
Quá trình sắp xếp các phần tương đồng giữa các trình tự của lợn Ỉ và các giống lợn đã công bố lần lƣợt theo cặp đƣợc thực hiện với thuật toán MUSCLE của phần mềm MEGA6, đây là bước đầu tiên trong việc xây dựng cây chủng loại phát sinh. Tuy nhiên thông qua thuật toán này, chúng tôi cũng đã quan sát đƣợc những khác biệt nhất định giữa trình tự trình tự của lợn Ỉ so với trình tự của các giống lợn khác.
a. So sánh trình tự D loop
Phần trình tự D loop cho thấy rất nhiều các điểm khác biệt về trình tự. Đa phần các khác biệt này là đơn nucleaotide. Với đoạn trình tự so sánh từ nucleotide thứ 151 tới vị trí nucleotide thứ 200 đƣợc thể hiện ở hình 3.9, có thể quan sát đƣợc tại các vị trí 154 (T/C), 159 (G/A), 182 (C/T) hay tại các vị trí khác nhƣ 295 (G/A), 307 (T/C),…
(phần này không đƣợc thể hiện trên hình) trình tự lợn Ỉ khác biệt với các giống lợn Duroc, Hampshire, Iberian, Landrace, Large white, Pietrain, WB-European thuộc châu Âu, Jeju, Korean native pig, giống lợn hoang WB-China northeast thuộc châu A. WB- Korea, WB-Malaysia cũng cho thấy các khác biệt với lợn Ỉ tại vị trí nucleotide thứ 182 (C/T). Vị trí nucleotide thứ 183, ngoại trừ các giống lợn Banna mini và Wei là có trình tự tương đồng là Cytosine, các giống lợn còn lại đều có trình tự chung là Thymine.
Ngoài ra còn có các vị trí khác không đƣợc thể hiện trên hình nhƣ nucleotide 215, 242, 503,… cũng là các điểm mà trình tự lợn Ỉ khác biệt với hầu hết các giống lợn khác.
Một cách tổng quát, các khác biệt này đa phần là giữa lợn Ỉ đối với các giống lợn có nguồn gốc châu Âu, tuy nhiên ở một số điểm trình tự D loop của lợn Ỉ còn cho thấy sự khác biệt về di truyền đối với hầu hết các giống lợn đƣợc so sánh trong nghiên cứu này, khá tương đồng với kết quả của phần trước của chúng tôi.
Hình 3.9. Một phần trình tự D loop của lợn Ỉ và các giống lợn đã được công bố sau khi tiến hành sắp xếp.
b. So sánh trình tự ty thể hoàn chỉnh
So sánh toàn bộ trình tự hoàn chỉnh cho phép chúng tôi tìm kiếm các khác biệt không chỉ tại vùng trình tự D loop với sự đa dạng cao đã đƣợc so sánh riêng, mà còn ở các vùng gen mã hóa và không mã hóa nằm trên hệ gen ty thể. Kết quả, các vùng có mức độ đa dạng cao thường rơi vào các vùng gen mã hóa cho protein và rRNA, trong khi các vùng còn lại tỏ ra khá bảo thủ. Hình 3.10 là đại diện cho các khác biệt cho các vùng gen đó, vùng đƣợc lựa chọn làm đại diện ở đây là hai đoạn trình tự nhỏ lần lƣợt thuộc các gen ND1 (hình 3.10A) và COX1 (hình 3.10B). Trong các đoạn này, giữa các
cũng có độ tương đồng trình tự cao nhưng giữa hai vùng địa lý này lại tồn tại sự khác biệt về trình tự nhƣ tại vị trí nucleotide thứ 4365 và 4386 (G/A) hay 6857 (A/T) và 6884 (G/A), các giống lợn Châu Âu ngoại trừ Duroc và Landraces có thêm vị trí khác biệt tại 4398 (T/C).. Tại các vùng gen biến đổi khác nhƣ 1560 (C/T), 1913 (A/G), 1988 (C/T),… thuộc vùng gen rRNA 12S; 2539 (T/C), 2990 (T/C),… thuộc vùng gen rRNA 16S, nhƣ 15652 (C/T), 15688 (T/C),… thuộc vùng gen Cytb và những điểm nằm phân bố trên các gen mã hóa cho protein khác, các giống lợn châu Âu cũng đều cho thấy sự khác biệt về trình tự so với lợn Ỉ.
Hình 3.10. Một phần trình tự hoàn chỉnh của lợn Ỉ và các giống lợn đã được công bố sau khi tiến hành sắp xếp.
A. Một phâng trình tự ND1, B. Một phần trình tự COX1