Hàm lượng Levofloxacin trong mẫu phẩm sinh học thường nhỏ vì thế việc nghiên cứu phương pháp để xử lý làm giàu mẫu là rất cần thiết. Hiện nay có hai phương pháp chiết thường dùng là chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn.
1.3.1.Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng
Chiết lỏng – lỏng là phương pháp chiết dựa theo sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau, thường một pha nước và pha còn lại là dung môi hữu cơ không tan hoặc rất ít tan vào trong nước. Quá trình chiết là quá trình chuyển chất tan từ pha nước vào pha hữu cơ được thực hiện qua bề mặt tiếp xúc giữa hai pha nhờ các tương tác hóa học giữa tác nhân chiết và chất cần chiết [3].
Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện chiết cần thiết. Điều kiện chiết chất phân tích đi vào pha hữu cơ:
- Dung môi chiết và dịch chiết là hai pha không đƣợc trộn lẫn, trong đó dung môi phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích.
- Hệ số tách α càng khác 1 càng tốt.
- Cân bằng dịch chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng để giải chiết đƣợc tốt
12
- Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm pH của dung dịch, nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia,…
Phương pháp chiết lỏng – lỏng có thể áp dụng cho chất vô cơ như các ion kim loại, các anion tan trong nước và chất hữu cơ với ưu điểm thiết bị đơn giản, dung môi dễ bay hơi.
Phương pháp này đã được F.A. Wong, S.J. Juzwin và S.C. Flor [14] sử dụng để xử lý mẫu huyết tương và nước tiểu ở người xác định Levofloxacin. Huyết tương (0,25ml) hoặc nước tiểu (0,01ml) được thờm 100àl chất nội chuẩn, 250àl dung dịch đệm phosphat sau đó thêm 4ml diclometan, hỗn hợp đƣợc trộn trong 30s và li tâm ở 2000 vòng/phút trong 5 phút. Pha hữu cơ được cô đặc dưới dòng khí nitơ. Phần cặn chiết cũn lại đƣợc hũa tan trong 100àl pha động là hỗn hợp của CuSO4.5H2O chứa L-isoleucine - metanol (87,5:12,5) và bơm vào hệ thống HPLC phân tích. Hiệu suất thu hồi trung bình ở các mức nồng độ khác nhau của mẫu huyết tương và nước tiểu tương ứng là 88 - 98% và 87 - 95%.
Cũng với phương pháp này T. Manish Kumar, Gurrala Srikanht, J.
Venkateshwar Rao và KRS. Sambasiva Rao [43] dùng để xử lý mẫu huyết tương người xác định Levofloxacin bằng dung môi etylacetat. Mẫu huyết tương tự tạo (0,05ml) trộn thờm 50àl chất nội chuẩn Gatifloxacin nồng độ 100ppm và đệm phosphat (pH = 2,5). Hỗn hợp đƣợc chiết với 3ml etylacetat sau đó li tâm ở 4000 vòng/phút trong 15 phút ở 40oC. Pha hữu cơ đƣợc bốc hơi dung môi bằng khí nitơ, phần cặn chiết cũn lại pha trong 400àl pha động và bơm vào hệ thống HPLC phõn tích. Hiệu suất thu hồi trung bình của Levofloxacin trong mẫu huyết tương là 85,95%.
1.3.2.Kỹ thuật chiết pha rắn
Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng đƣợc cải tiến thành hấp thụ pha rắn với các cơ chế khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau. Trong đó chất tan ban đầu ở pha lỏng (nước hoặc
13
dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn [3,5].
Pha rắn (còn được gọi là pha tĩnh) thường là các hạt silicagel xốp, trung tính, hạt oxit nhôm, silicagel trung tính đã đƣợc ankyl hóa nhóm –OH bằng các gốc hydrocacbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,… hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các lại nhựa hoặc than hoạt tính… Các hạt này được nhồi vào cột chiết nhỏ (thường là cột có kích thước 5 x 1cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1-2mm với đường kính 3- 4cm (đĩa chiết).
Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ hoặc dung dịch đệm… Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tương tác với chất cần phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu.
Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích đƣợc thực hiện bằng một dung môi thích hợp. Ví dụ: chất hữu cơ thường được rửa giải bằng aceton, acetonitrile, methanol,…; kim loại thường được rửa giải bằng dung dịch axit. Thông thường, thể tích rửa giải nhỏ hơn nhiều lần so với thể tích mẫu ban đầu, điều này có nghĩa chất phân tích đã đƣợc làm giàu.
Điều kiện chiết pha rắn:
Pha rắn hay pha lỏng phải có tính chất hấp phụ hay trao đổi chọn lọc với một hay một nhóm ion nhất định.
Hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết phải lớn, để hiệu quả chiết cao.
Quá trình chiết phải xảy ra nhanh, nhanh đạt đến cân bằng nhƣng không có tương tác hóa học làm mất hay hỏng chất phân tích.
Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch cao để có thể rửa giải chất phân tích ra khỏi pha lỏng.
14 Không làm nhiễm bẩn chất phân tích.
Sự chiết đƣợc thực hiện trong một số điều kiện nhất định, phù hợp, lặp lại đƣợc, càng đơn giản càng tốt.
Hiện nay chiết pha rắn đang đƣợc sử dụng phổ biến trong lĩnh vực phân tích cho mục đích xác định cả các chất vô cơ và hữu cơ, các kim loại và phi kim do những ƣu điểm sau:
- Hiệu suất thu hồi cao.
- Cân bằng chiết đạt nhanh và có tính thuận nghịch.
- Thích hợp cho mẫu lƣợng nhỏ và phân tích lƣợng vết các chất.
- Thao tác đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt.
- Khả năng làm giàu và làm sạch chất phân tích lớn.
Trong phương pháp HPLC xác định đồng thời Zidovudine (AZT) và Levofloxacin trong huyết tương người William V. Caufied [46] đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn để làm sạch mẫu huyết tương. Cột chiết pha rắn C18 1cc/100mg được hoạt hóa cột bằng 1ml Metanol, sau đó với 1ml nước deion và 1ml đệm Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4). Mẫu huyết tương được thờm 100àl chất nội chuẩn trước khi đưa lờn cột chiết, sau đú rửa tạp 3 lần với 250àl đệm Na2HPO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4), cuối cựng đƣợc rửa giải với 1,0 ml hỗn hợp đệm NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) – MeOH (95:5). Hỗn hợp thu đƣợc đem cô cạn sau đó đƣợc pha loãng với pha động. Zidovudine và Levofloxacin đƣợc tách trên cột C18, với pha động là hỗn hợp của NaH2PO4 25mM chứa axit trifluoroacetic 0,1% (pH = 2,4) : ACN (86:14). Hiệu suất thu hồi của Zidovudine là 94,1%, Levofloxacin là 91,2% và của chất nội chuẩn là 84,7%.
Chiết pha rắn và phương pháp sắc ký lỏng được phát triển bởi Hing-Biu Lee và các cộng sự [20] để xác định ba Fluoroquinolone (FQs) gồm Ofloxacin, Norfloxacin, Ciprofloxacin trong mẫu nước thải đô thị. Các FQs được chiết trên cột chiết pha rắn Oasis WCX trao đổi cation yếu. Cột đƣợc hoạt hóa bằng 4ml metanol
15
sau đó 10ml nước pH = 3, mẫu được đưa lên cột với tốc độ 10 – 15ml/ phút, rửa tạp bằng 100ml nước pH = 3 sau đó 5ml metanol, cuối cùng được rửa giải bằng hỗn hợp metanol, acetonitril và axit formic (25:75:5). Hỗn hợp đem bốc hơi dung môi ở nhiệt độ 40oC bằng cách thổi khí nitơ sau đó pha loãng với 1ml dung môi pha động.
Các FQs đƣợc tách trên cột Zorbax SB-C8 với pha động là hỗn hợp actonitril - metanol - axit formic - nước (6/12/0,5/81,5), tốc độ dòng chảy 0,2ml/phút. Các FQs được định lượng theo 2 phương pháp LC/MS/MS và ESI LC/MS. Độ thu hồi của FQs trong mẫu nước thải khoảng 87 - 94% với độ lệch chuẩn tương đối ít hơn 6%.
Ba FQs được phát hiện trong tất cả các mẫu nước thải với nồng độ trung bình khoảng 34 và 251ng/ l.
Các Fluoroquinolone kháng sinh tổng hợp đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học.
Từ mục đích này, O. Ballesteros và các cộng sự [37] đã phát triển phương pháp xác định ba Fluoroquinolones sử dụng rộng rãi (Norfloxacin, Ciprofloxacin và Ofloxacin) trong nước tiểu người bằng phương pháp sắc ký lỏng (LC) kết hợp với khí nén hỗ trợ electrospray ion hóa (ESI) khối phổ (MS). Mẫu nước tiểu trước khi định lượng được làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn. Mẫu nước tiểu được lấy từ các tình nguyện viên khỏe mạnh sau đó đem ly tâm 10 phút và lọc qua màng 0,45àm. Cột chiết được hoạt húa bằng 2ml metanol tiếp theo 2ml nước, đưa 10ml mẫu thêm chuẩn lên cột, sau đó rửa tạp bằng 2ml nước, cuối cùng rửa giải bằng 3ml hỗn hợp ACN - TFA 2% (25:75). Bốc hơi dung môi hỗn hợp thu đƣợc sau đó pha loãng bằng pha động là hỗn hợp của acetonitril - đệm amoni acetat (pH = 2,5) (20:
80). Độ thu hồi trong mẫu nước tiểu người của Norfloxacin là 46,0%, của Ofloxacin là 65,1%, của Ciprofloxacin là 61,9%. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10ng/
ml đối với ba Fluoroquinolones.
16