3.1. Khảo sát các điều kiện phân tích Levofloxacin trên thiết bị HPLC
3.1.2. Khảo sát pha động
3.1.2.1. Khảo sát thành phần pha động
Một trong các yếu tố quan trọng nhất trong phương pháp HPLC chính là thành phần pha động. Nó không những ảnh hưởng đến khả năng tách, thời gian lưu mà còn quyết định dạng tồn tại và hình dáng pic của chất phân tích. Qua tham khảo tài liệu thì các hệ pha động MeOH - đệm phosphat 50mM pH = 3,5 (70:30); MeOH - đệm acetat 50mM pH = 3,5(70:30); ACN-H2O-TEA (20:80:0,3); ACN - đệm acetat 50mM pH = 3,5 (20:80) và ACN - đệm phosphat 50mM pH = 3,5 (20:80) đã
200 300 400 500 600 700 nm
0.0 2.5 5.0
mAU(x10) 7.07/ 1.00
200 319
264 771732
295
226 324 655442
25
đƣợc sử dụng để đo Levofloxacin với các điều kiện đo: nồng độ Levofloxacin 9,68ppm và tốc độ pha động 1,0ml/ phút.
MeOH/phosphat MeOH/acetat
ACN/acetat ACN-H2O-TEA
0.0 2.5 5.0 7.5 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75
mAU(x100) 295nm4nm (1.00)
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75
mAU(x100) 295nm,4nm (1.00)
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
-1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
mAU(x10) 295nm,4nm (1.00)
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
mAU(x10) 295nm4nm (1.00)
26 ACN/phosphat
Hình 3. 2: Sắc kí đồ của Levofloxacin với các hệ pha động khác nhau
Dựa vào sắc ký đồ với các hệ pha động MeOH - đệm phosphat; MeOH - đệm acetat; ACN-H2O-TEA và ACN - đệm acetat cho thấy pic của Levofloxacin bị doãng chân píc và tín hiệu píc không tốt. Hơn nữa, với hai hệ pha động MeOH - đệm phosphat và MeOH - đệm acetat thời gian lưu ngắn nên nếu trong nền mẫu nước tiểu dễ bị ảnh hưởng bởi píc tạp trong khi, hệ pha động ACN - đệm phosphat cho kết quả ngƣợc lại. Do đó, để phù hợp thì hệ pha động ACN - đệm phosphat đã được sử dụng do píc cân đối, thời gian lưu tuy có lớn hơn so với hai hệ pha động MeOH-đệm phosphat và MeOH - đệm acetat nhƣng có thể hạn chế đƣợc sự ảnh hưởng của píc tạp. Vậy hệ đệm ACN - đệm phosphat được sử dụng cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2.2. Khảo sát tỷ lệ pha động
Trong nghiên cứu này sử dụng thành phần pha động là ACN - đệm phosphat 50mM ( pH=3,5), tốc độ dòng 1ml/phút. Tỷ lệ pha động có ảnh hưởng đến khả năng hòa tan chất phân tích, Levofloxacin là chất phân cực trung bình nên pha động có độ phân cực càng mạnh hoặc càng kém khả năng hòa tan Levofloxacin càng kém,
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
mAU(x100) 295nm,4nm (1.00)
27
dẫn đến định lƣợng chất phân tích không chính xác. Từ đó, tôi thay đổi tỷ lệ của pha động và kết quả thu đƣợc nhƣ trong hình sau.
Hình 3. 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha động đến quá trình định lượng Levofloxacin Từ đồ thị cho thấy hệ ACN - đệm phosphat từ tỷ lệ 15:85 đến 30:70 Spic tăng dần, từ tỷ lệ 30:70 đến 40:60 Spic không thay đổi nhiều, có xu hướng giảm đi nhƣng không đáng kể do đó tỷ lệ pha động ACN - đệm phosphat là 30:70 đƣợc chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.1.2.3. Khảo sát pH của dung dịch đệm pha động
Hầu hết các nghiên cứu chất kháng sinh nhóm quinolone đều sử dụng hệ dung dịch đệm pha động trong khoảng pH từ 2 – 5. Chúng tôi thực hiện khảo sát pH của dung dịch đệm pha động tại các giá trị: 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 và 5,0 trong khi cố định nồng độ dung dịch đệm là 50mM với tốc độ dòng 1ml/phút. Kết quả đƣợc trình bày ở đồ thị sau:
0 400,000 800,000 1,200,000 1,600,000 2,000,000
15-85 20-80 25-75 30-70 35-65 40-60
Diện tích pic (mAu)
Tỷ lệ pha động
Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tỷ lệ pha động
28
Hình 3. 4: Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến quá trình định lượng Levofloxacin Với giá trị pH của dung dịch đệm pha động dao động từ 2 đến 3,5 diện tích pic thay đổi ít, khi giá trị pH thay đổi trong khoảng pH từ 4 đến 5 diện tích pic thay đổi rõ rệt. Nguyên nhân là do giá trị pKa của Levofloxacin nằm trong khoảng 5,59 – 7,94 nên trong môi trường pH lớn hơn 4 chất phân tích tồn tại ở dạng anion có độ phân cực lớn do đó khả năng lưu giữ trên cột sắc ký giảm. Từ kết quả trên pH = 3,5 đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo nhằm thu đƣợc tín hiệu tốt nhất.
3.1.2.4. Khảo sát nồng độ đệm của pha động ở pH = 3,5
Nhằm thu đƣợc tín hiệu tốt nhất đồng thời tránh lãng phí hóa chất và kéo dài tuổi thọ của cột sắc ký thì sau khi khảo sát pH thì yếu tố khảo sát tiếp theo là nồng độ đệm là cần thiết. Trong nghiên cứu này khảo sát các nồng độ của đệm phosphat là 10mM; 20mM và 50mM. Với các điều kiện khác: nồng độ Lev 9,68ppm;
pH=3,5; tỉ lệ pha động ACN - đệm phosphat (30:70) và tốc độ dòng 1ml/ phút. Kết quả thu đƣợc trình bày trong hình sau:
1,700,000 1,750,000 1,800,000 1,850,000 1,900,000
1.5 2.5 3.5 4.5 5.5
Diện tích píc (mAu)
pH
Sự phụ thuộc diện tích pic vào pH của dung dịch đệm
29
Hình 3. 5: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm đến quá trình định lượng Levofloxacin
Dựa vào hình 3.5 nhận thấy diện tích pic thay đổi rõ rệt khi nồng độ dung dịch đệm thay đổi từ 10mM đến 20mM, diện tích pic ít thay đổi khi nồng độ dung dịch đệm thay đổi từ 20mM đến 50mM. Khi thêm muối vào pha động tức là đã tăng độ phân cực cho pha động vì vậy khi nồng độ muối tăng, chất phân tích tan vào pha động tốt hơn, đến mức độ nhất định khả năng hòa tan dừng lại và có thể giảm khi độ phân cực quá mạnh. Do đó, để tránh tốn hóa chất và khả năng hòa tan chất phân tích tốt nhất thì nồng độ dung dịch đệm pha động đƣợc chọn là 20mM cho khảo sát tiếp theo.
3.1.2.5. Khảo sát tốc độ dòng pha động
Trong hệ sắc ký thì tốc độ pha động ảnh hưởng tới hiệu quả tách sắc ký vì nó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong 2 pha tĩnh và pha động.
Khi tốc độ pha động nhỏ, thời gian lưu của chất phân tích lớn, gây doãng pic, giảm độ nhạy. Khi tốc độ pha động quá lớn có thể làm ảnh hưởng đến hiệu quả tách của chất phân tích với tạp, gây áp suất lớn làm hƣ hại cột và tiêu tốn dung môi.
Các điều kiện khảo sát: nồng độ Lev 9,68ppm; pH=3,5; tỉ lệ pha động ACN - đệm phosphat (30:70); nồng độ đệm 20mM và sự thay đổi tốc độ dòng 0,6ml/ phút;
0,8 ml/ phút; 1,0 ml/ phút; 1,2 ml/ phút và 1,5 ml/ phút.
1,710,000 1,740,000 1,770,000 1,800,000 1,830,000 1,860,000 1,890,000
10mM 20mM 50mM
Diện tích pic (mAu)
Nồng độ dung dịch đệm (mM)
Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ dung dịch đệm
30
Bảng 3. 1: Sự phụ thuộc diện tích pic vào tốc độ dòng pha động
Tốc độ dòng (ml/ phút) tR (phút) Spic
0,6 9,24 2679852
0,8 6,89 2134167
1,0 5,46 1860265
1,2 4,59 1363680
1,5 3,69 1170123
Hình 3. 6: Sắc ký đồ của Levofloxacin khi thay đổi tốc độ dòng khác nhau
31
Kết quả thu được cho thấy, khi tăng tốc độ dòng thì thời gian lưu và diện tích pic cùng giảm dần. Thời gian lưu ngắn thì khi phân tích trong nền phức tạp như mẫu nước tiểu dễ bị ảnh hưởng của tạp chất. Do đó, nhằm tăng giới hạn phát hiện cho phương pháp tốc độ dòng được chọn là 0,8ml/ phút.
3.1.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng(LOQ) của thiết bị
Dựa vào cách tính ở mục 2.5.2, tại giá trị nồng độ nhỏ nhất có thể đo đƣợc tín hiệu của Levofloxacin là ở 0,015ppm và dựa vào cách tính đó ta thu đƣợc kết quả trong bảng dưới đây với số lần đo lặp lại 3 lần.
Bảng 3. 2: Giới hạn phát hiện (LOD) của Levofloxacin
Số lần đo Chiều cao
pic Chiều cao pic
trung bình Chiều cao
nền S/N
1 192
191,67 56 3,42
2 198
3 185
Với cách tính nhƣ mục 2.5.2, thì giá trị LOD của Levofloxacin thu đƣợc là 0,015ppm. Giá trị của giới hạn định lƣợng bằng 10 lần giá trị S/N. Vậy từ đó, ta thu các giá trị LOD và LOQ lần lƣợt là 0,015ppm và 0,05ppm.
3.1.4. Xây dựng đường chuẩn định lượng Levofloxacin
Trong sắc ký lỏng, để định lượng thì nồng độ chất phân tích phải có tương quan tuyến tính với thông số đo của detector. Thực hiện quá trình đo các dung dịch chuẩn đƣợc pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ biến thiên trong khoảng 0,05-150ppm. Mỗi dung dịch đƣợc bơm trên máy HPLC 3 lần, diện tích pic trung bình thu được sẽ là số liệu để dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ. Các điều kiện đo trên cơ sở điều kiện đã chọn nêu ở bảng sau và diện tích pic trung bình của các chất thu đƣợc nhƣ trong bảng sau.
Bảng 3. 3: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin
32
Nồng độ Levofloxacin (ppm) Diện tích píc
0,05 10671
0,10 21342
0,20 42683
0,50 106708
1,0 213417
5,0 1067084
10,0 2134167
20,0 4268334
50,0 10670835
100 21341670
150 32012505
Hình 3. 7: Đường chuẩn của Levofloxacin
Chất phân tích có khoảng tuyến tính rộng từ 0,05 - 150ppm với hệ số tương quan R2 = 0,9999 đồng thời giá trị P value<0,05 chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính.
Phương trình hồi quy của Levofloxacin có dạng:
y = 213417x + 0,0743 R² = 0,9999
0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 35000000
0 50 100 150 200
Diện tích pic (mAu)
Nồng độ của Levofloxacin (ppm) Đường chuẩn của Levofloxacin