3.3. Tối ƣu các điều kiện của quy trình chiết nhằm xác định Levofloxacin
3.3.1. Khảo sát quy trình chiết lỏng - lỏng
Trong kỹ thuật chiết lỏng – lỏng việc lựa chọn đƣợc dung môi là vô cùng quan trọng. Để có đƣợc kết quả chiết tốt, dung môi chiết phải hòa tan tốt chất phân tích, nhƣng lại không hòa tan tốt các chất khác có trong mẫu, hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết đƣợc triệt để. Dựa trên cơ sở này và tham khảo các tài liệu, tôi đã lựa chọn 4 hệ dung môi sau để khảo sát:
- Diclometan - Cloroform - Etylacetat
- Metanol/diclometan (1:9) Quy trình chiết:
Lấy một thể tích chính xác mẫu thử tự tạo ([Lev] = 4,84ppm), thêm một lƣợng dung dịch đệm phosphat (pH = 3,5) theo tỷ lệ 1:1, trộn 30 giây trên máy vortex 4000 vũng/phỳt, sau đú lọc qua màng 0,45àm, thu đƣợc dung dịch 1. Lấy 1ml dung dịch 1, thêm 5ml dung môi chiết. Lắc kỹ với tốc độ 200 vòng/phút trong 30 phút. Ly tâm 7000 vòng/phút trong 15 phút. Lấy 4ml phần dung môi hữu cơ, sau đó cô đuổi dung môi bằng khí N2 ở nhiệt độ 40oC. Hòa tan cặn thu đƣợc trong 2,00ml dung mụi pha động. Lọc qua màng 0,45àm sau đú đƣa vào hệ thống HPLC
42
với các thông số máy đã chọn. Trong nghiên cứu quy trình này tôi sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định chính xác nồng độ chất phân tích trong mẫu nước tiểu.
Hình 3. 14: Sắc ký đồ của mẫu nước tiểu khi sử dụng các dung môi chiết khác nhau trong kĩ thuật chiết lỏng-lỏng
Dựa vào phương pháp thêm chuẩn để xác định nồng độ thì thu được kết quả thu đƣợc thể hiện trong hình sau:
43
Hình 3. 15: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến độ thu hồi của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng
Bằng cách dùng phương pháp thêm chuẩn thì nồng độ của Levofloxacin đã đƣợc xác định khi sử dụng các dung môi khác nhau để chiết Levofloxacin trong nước tiểu. Từ đồ thị và hình thì có thể nhận ra với hỗn hợp dung môi MeOH/diclometan (1:9) thu đƣợc hiệu suất thu hồi cao nhất 96,11%, tuy nhiên, tại vị trí xuất hiện của pic Levofloxacin thì xuất hiện một pic tạp lạ. Pic lạ cũng xuất hiện khi sử dụng Cloroform và Etylactat làm dùng dung môi chiết, hơn nữa, píc tạp đó còn khá rõ. Ngƣợc lại, khi sử dụng dung môi diclometan hiệu suất thu hồi (86,98%) tuy nhỏ hơn khi sử dụng hỗn hợp dung môi MeOH/diclometan (1:9) nhƣng lại không xuất hiện píc tạp tại vị trí của Levofloxacin. Do đó để tránh ảnh hưởng đến kết quả phân tích thì dung môi diclometan đã được chọn làm dung môi chiết trong nước tiểu.
3.3.1.3. Khảo sát tỷ lệ trộn mẫu với dung dịch đệm
Yếu tố khảo sát tiếp theo đƣợc chọn là tỷ lệ trộn mẫu với dung dịch đệm. Do khi pha loãng mẫu thì đồng nghĩa các chất tạp cũng giảm, tuy nhiên có thể làm giảm tín hiệu của chất phân tích, bởi vì làm giảm hiệu quả chiết.
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
120.00%
Cloroform Etylacetat Diclometan MeOH/diclometan (1:9)
Hiệu suất thu hồi (%)
Dung môi
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào dung môi chiết
44
Trong nghiên cứu này, các tỷ lệ giữa mẫu:đệm phosphat đƣợc nghiên cứu là 3:1; 2:1; 1:1; 1:2 và 1:3.
Hình 3. 16: Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu : đệm phosphat đến độ thu hồi của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng
Nhận thấy rằng khi càng tăng thể tích mẫu thì hiệu suất thu hồi càng giảm dần có thể do lượng tạp chất cao gây ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chất phân tích vào pha hữu là chƣa tốt. Còn khi càng tăng tỉ lệ dung dịch đệm hiệu suất thu hồi cũng giảm tuy nhiên giảm chậm do nồng độ chất phân tích càng nhỏ thì phân tán vào pha hữu cơ cũng giảm theo và tỷ lệ đạt đƣợc hiệu suất thu hồi cao nhât là 1:1. Do đó, tỷ lệ này đƣợc chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.3.1.4. Khảo sát pH dung dịch đệm
Một trong các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết là pH. Do nó ảnh hưởng đến hệ số phân bố và dạng tồn tại của chất trong dung dịch dẫn đến hiệu suất thu hồi của chất phân tích cũng bị ảnh hưởng. Chính vì các lý do đó thì các giá trị pH được chọn để khảo sát là 2,00; 2,50; 3,00 và 4,00. Các kết quả thu đƣợc biểu diễn trong hình sau:
65%
70%
75%
80%
85%
90%
Hiệu suát thu hồi (%)
Tỷ lệ mẫu:đệm phosphat
Sự phụ thuộc của hiệu suất thi hồi vào tỷ lệ mẫu:đệm phosphat
3:1 2:1 1:1 1:2 1:3
45
Hình 3. 17: Ảnh hưởng của pH dung dịch đệm đến độ thu hồi của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng
Từ đồ thị, chỉ có tại pH=3 thì cho giá trị hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu là tốt nhất 87%. Điều này có thể lí giải rằng, pH càng nhỏ thì nồng độ H+ càng lớn sẽ chiếm chỗ chất phân tích, đẩy chất phân tích ra ảnh hưởng đến khả năng đi vào dung môi hữu cơ của chất phân tích.Với pH càng tăng, chất phân tích sẽ phân li thành anion không đi vào dung môi hữu cơ đƣợc. Do đó, pH=3 đƣợc chọn cho các khảo sát tiếp theo.
3.3.1.5. Khảo sát thể tích dung môi chiết
Thể tích dung môi chiết là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi khi xử lý mẫu bằng kĩ thuật chiết lỏng lỏng. Nếu lƣợng dung môi quá ít thì hiệu quả chiết sẽ không cao do sự phân bố của chất vào pha hữu cơ thấp. Ngƣợc lại khi càng tăng thể tích dung môi chiết thì lƣợng chất phân tích đi vào pha hữu cơ càng nhiều, tuy nhiên, khi lƣợng thể tích dung môi chiết càng lớn thì sẽ lãng phí hóa chất, gây khó khăn trong quá trình cô đuổivà thời giankhi cô đuổi dung môi. Từ đó, các thể tích dung môi diclometan dùng chiết đƣợc chọn là 3ml, 4ml, 5ml, và 6ml.
Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện trong hình sau:
0%
20%
40%
60%
80%
100%
2 2.5 3 3.5 4
Hiệu suất thu hồi (%)
pH
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào pH của dung dịch đệm
46
Hình 3. 18: Ảnh hưởng của thể tích dung môi chiết đến độ thu hồi của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng
Từ số liệu thu đƣợc nhận thấy rằng khi càng tăng thể tích dung môi diclometan thì hiệu suất thu hồi đạt đƣợc càng cao, nhƣng đến một lƣợng nhất định thì hiệu suất đó gần nhƣ không thay đổi nhiều (tại 5 và 6ml dung môi diclometan).
Và để tiết kiệm lƣợng dung môi khi chiết cũng nhƣ thời gian cô dung môi thì thể tích dung môi để sử dụng cho chiết lỏng-lỏng là 5ml.
Nhƣ vậy, quy trình chiết lỏng lỏng tối ƣu ở bảng sau:
Bảng 3. 7: Điều kiện chiết tối ưu của quy trình chiết lỏng – lỏng
STT Điều kiện chiết Nội dung
1 Dung môi chiết Diclometan
2 Tỷ lệ trộn mẫu với dung dịch đệm 1:1
3 pH dung dịch 3
4 Thế tích dung môi chiết 5ml
Quy trình chiết lỏng lỏng:
0%
20%
40%
60%
80%
100%
3 4 5 6
Hiệu suất thu hồi (%)
Thể tích dung môi (ml)
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích dung môi chiết
47
Hình 3. 19: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo theo quy trình chiết lỏng – lỏng đã tối ưu
3.3.1.6. Thẩm định phương pháp a. Độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu nước tiểu (không có chất phân tích). Sắc ký đồ phân tích trên máy HPLC đối với mẫu trắng phải không cho tín hiệu tại thời gian lưu tương ứng với chất phân tích.
48
Kết quả so sánh mẫu nước tiểu thêm chuẩn với nền mẫu nước tiểu trắng như sau:
Hình 3. 20: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong nước tiểu sử dụng quy trình chiết lỏng-lỏng
Từ sắc ký đồ có thể thấy rằng khi chiết mẫu trắng (nước tiểu) sau đó phân tích trên thiết bị HPLC thì không thấy sự xuất hiện pic tạp trùng với vị trí của chất phân tích Lev. Đường nền tại vị trí pic Lev cho tín hiệu thấp. Như vậy, phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng đƣợc yêu cầu.
b. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp đƣợc xác định bằng cách thêm dung dịch chuẩn Levofloxacin vào nền mẫu nước tiểu (mẫu trắng) sao cho hàm lượng chất phân tích có trong mẫu khá nhỏ. Xử lý mẫu và thực hiện phân tích trên thiết bị HPLC-PDA theo các điều kiện đã chọn.
Tìm nồng độ chất phân tích tối thiểu trong nền mẫu sao cho sau khi tách chiết, làm sạch và đƣa vào máy phân tích ghi nhận tín hiệu chiều cao pic chất (S) trên sắc ký đồ và pic nhiễu nền (N). Tính giá trị S/N cho chất phân tích.
49
Giới hạn phát hiện của phương pháp được chấp nhận khi tỷ lệ giữa tín hiệu và nhiễu nền (S/N) đạt xấp xỉ 3 – 15.
Giới hạn định lƣợng đƣợc chấp nhận MQL ≈ 3,3 x MDL
Bảng 3. 8: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp chiết lỏng – lỏng
Giá trị
Nồng độ Lev thêm vào (ppm) 0,03
Chiều cao pic trung bình 307,12
Chiều cao nền mẫu blank 83
Tỷ lệ S/N 3,70
MDL (ppm) 0,03
MQL (ppm) 0,1
c. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu nước tiểu theo quy trình chiết lỏng – lỏng Pha dãy chuẩn Levofloxacin trong mẫu nước tiểu trắng có nồng độ từ 0,1ppm đến 20ppm. Tiến hành sắc ký nhƣ các điều kiện đã chọn. Kết qủa đƣợc ghi trong bản sau:
Bảng 3.9: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin theo phương pháp chiết lỏng – lỏng
Nồng độ (ppm) Spic (mAu)
0,1 21453
0,5 106250
50
1 231687
5 1072500
10 2093010
20 4291960
Hình 3. 21: Đường chuẩn của Levofloxacin theo phương pháp chiết lỏng – lỏng Chất phân tích trong nền mẫu nước tiểu có khoảng tuyến tính từ 0,1ppm- 20ppm với hệ số tương quan R2 = 0,9998
Phương trình hồi quy của Levofloxacin có dạng:
Y = 213650X – 454,22
Trong đó Y là diện tích pic, X là nồng độ Levofloxacin y = 213650x - 454,22
R² = 0,9998
0 900,000 1,800,000 2,700,000 3,600,000 4,500,000 5,400,000
0 5 10 15 20 25
Diện tích pic (mAu)
Nồng độ (ppm)
Đường chuẩn Levofloxacin theo phương pháp chiết lỏng lỏng
51
Sử dụng phương pháp thống kê kiểm tra thấy Ftính< Fbảng nghĩa là sự sai khác giữa giá trị hệ số a không có sự khác nhau có nghĩa với giá trị 0 ở độ tin cậy 95%
hay phương pháp không mắc sai số hệ thống.
d. Đánh giá độ chụm của phương pháp
Độ chụm của phương pháp được đánh giá thông qua độ lặp lại. Trong nghiên cứu tiến hành chiết lặp lại 3 lần ở mức nồng độ4,84ppm. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng sau:
Bảng 3. 10: Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp chiết lỏng – lỏng
Lần chiết 1 2 3
Nồng độ Lev thêm chuẩn (ppm) 4,84 4,84 4,84 Nồng độ Lev thu hồi (ppm) 4,3 4,25 4,19
Hiệu suất thu hồi (%) 88,79% 87,79% 86,57%
RSD % 1,27
Từ bảng số liệu thì giá trị độ lệch chuẩn tương đốiRSD% rất nhỏ (1,27%) sau khi làm lặp 3 lần ở mức nồng độ4,84ppm. Từ đó có thể nhận xét phương pháp có độ chụm cao và kết quả thu đƣợc đáng tin cậy.
e. Đánh giá độ đúng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi của phương pháp phân tích, bao gồm cả xử lý mẫu và đo mẫu phân tích. Để đánh giá độ đúng của phương pháp thì tiến hành khảo sát chiết mẫu trắng đã thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ 0,484ppm, 4,84ppm, 9,68ppm, với quy trình chiết lỏng lỏng tối ƣu nhƣ đã nêu trong mục 3.3.1.5. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng sau:
52
Bảng 3. 11: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp chiết lỏng – lỏng
Tên Mức 1 Mức 2 Mức 3
Nồng độ Lev chuẩn thêm (ppm) 0,484 4,84 9,68 Nồng độ Lev thu hồi (ppm) 0,43 4,3 8,54
Hiệu suất thu hồi (%) 86,93% 88,79% 88,22%
Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 87,98%
Dựa vào số liệu bảng trên thì hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu cũng như khi phân tích trên thiết bị tương đối tốt (hiệu suất thu hồi trung bình 87,98%).
Qua đó, thấy rằng phương pháp có độ đúng tốt có thể áp dụng để phân tích Levofloxacin trong mẫu nước tiểu.