3.3. Tối ƣu các điều kiện của quy trình chiết nhằm xác định Levofloxacin
3.3.2. Khảo sát quy trình chiết pha rắn
Dựa vào các nghiên cứu trước đây và điều kiện phòng thí nghiệm, tôi đã sử dụng các cột với thể tích nhƣ sau:
- Cột ChromfilterC18 500mg, 6ml - Cột Water Oasis HLB, 6ml
- Cột Agilent Bond Elut PLEXA, 500mg, 6ml
Cột chiết C18 chất hấp thu là octadecyl, cột HLB chất hấp thu là polime được trùng hợp từ N-vinylpyrolidone có tính ưa nước và divinylbenzen có tính kị nước, cột PLEXA chất hấp thu cũng là polime nhưng được trùng hợp từ divinylbenzen.
Quy trình chiết pha rắn:
Trước tiên hoạt hóa cột bằng 3,0ml metanol; 3,0ml nước và cân bằng pH của cột bằng 6,0ml dung dịch đệm phosphat 20mM pH = 3 với tốc độ dòng 3ml/ phút.
Sau đó đƣa 1,0ml dung dịch chuẩn Levofloxacin lên cột với tốc độ dòng 1ml/ phút.
Làm khô cột sau đó rửa giải bằng 10,0ml ACN với tốc độ dòng 1ml/ phút (thể tích này để đảm bảo chất phân tích đƣợc rửa ra hoàn toàn). Để cô đuổi dung môi thì sử
53
dụng khí N2 ở nhiệt độ 40oC. Cuối cùng để hòa tan cặn thu đƣợc trong pha động, lọc qua màng 0,45àl sau đú đƣa vào hệ thống HPLC với cỏc thụng số đó chọn.
Kết quả so sánh độ thu hồi chất chuẩn Levofloxacin nồng độ 19,36ppm qua cột C18, HLB và PLEXA đƣợc trình bày ở hình và bảng sau:
Bảng 3. 12: Ảnh hưởng của cột chiết pha rắn đến độ thu hồi chất chuẩn Levofloxacin theo quy trình chiết pha rắn
Cột C18 HLB PLEXA
Nồng độ Lev đi qua cột (ppm) 19,36 19,36 19,36 Nồng độ Lev tìm lại đƣợc (ppm) 15,24 16,59 15,04 Hiệu suất thu hồi (%) 78,70% 97,70% 79,70%
Từ bảng số liệu cho thấy khi sử dụng các cột C18 và PLEXA thì hiệu suất thu hồi đều nhỏ hơn 80%. Ngƣợc lại thì cột HLB lại thu đƣợc hiệu suất thu hồi của Levofloxacin khá cao 97,70%. Điều này có thể giải thích cột HLB đƣợc trùng hợp từ hai monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ưa nước và divinylbenzen có tính kị nước nên khả năng giữ chất phân tích tốt nhất trong ba loại cột khảo sát, trong khi hai cột C18 và PLEXA cùng là cột không phân cực. Nhƣ vậy, cột HLB được sử dụng làm cột chiết Levofloxacin trong nước tiểu.
3.3.2.2. Khảo sát thành phần dung dịch rửa tạp
Nền mẫu nước tiểu thường khá phức tạp, chứa rất nhiều chất khác nhau như ezym, vitamin, axit amin, các hợp chất hữu cơ và các ion nhƣ: Na+, NH4+, Mg2+, Cl- ,… để giảm sự ảnh hưởng của các chất này đến kết quả phân tích thì cần phải lựa chọn dung môi rửa tap phù hợp, thêm vào đó, do Levofloxacin là chất phân cực trung bình thế nên các dung môi rửa tạp đƣợc chọn là:
1. 5ml nước deion.
2. 5ml nước deion được điều chỉnh pH = 3 bằng axit CH3COOH.
3. 5ml dung dịch đệm phosphat 20mM pH = 3.
4. 5ml dung dịch nước deion/MeOH (95:5).
54
5. 5ml hỗn hợp dung dịch nước deion/MeOH (95:5) và dung dịch đệm phosphat 20mM pH = 3 (1:1).
Mẫu thử là mẫu nước tiểu trắng được thêm dung dịch chuẩn ([LEV] = 4,84ppm). Hoạt hóa cột bằng 3,0ml metanol; tiếp theo 3,0ml nước và 6,0ml dung dịch đệm phosphat 20mM pH = 3 với tốc độ dòng 3ml/ phút. Sau đó đƣa 1,0ml mẫu thử tự tạo lên cột với tốc độ dòng 1ml/ phút. Làm khô cột sau đó rửa tạp bằng các dung môi đã chọn để khảo sát. Rửa giải bằng 5ml ACN với tốc độ dòng 1ml/ phút.
Hình 3. 22: Sắc ký đồ của mẫu nước tiểu khi sử dụng các dung môi rửa tạp khác nhau trong kĩ thuật chiết pha rắn
55
Bảng 3. 13: Ảnh hưởng của dung môi rửa tạp đến hiệu suất thu hồi của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu theo quy trình chiết pha rắn
STT Dung môi rửa tạp Hiệu suất thu
hồi (%)
1 Nước deion 82,39%
2 Nước deion được điều chỉnh pH = 3 bằng axit
CH3COOH 89,85%
3 Dung dịch đệm phosphat pH = 3 93,29%
4 Dung dịch nước deion/MeOH: 95:5 53,19%
5 hỗn hợp dung dịch MeOH 5% và dung dịch đệm
phosphat pH = 3 (1:1) 65,51%
Từ sắc kí đồ có thể thấy rõ là khi sử dụng các dung dịch rửa tạp 1, 2, 4 và 5 thì tại ví trí píc của Levofloxacin xuất hiện sự dâng nền và dính chân với píc tạp, chính điều này có thể làm ảnh hưởng đến độ chính xác cũng như độ nhạy của việc định lượng Levofloxacin trong nền nước tiểu. Tuy nhiên, khi sử dụng dung dịch rửa tạp 3 mặc dù nền mẫu bị dâng nhƣng Levofloxacin đã tách hoàn toàn so với píc tạp ( R=1,53 và 1,77 lần lƣợt so với 2 píc liền kề ) và cũng đạt đƣợc hiệu suất thu hồi rất cao là 93,29%. Do đó, dung dịch rửa tạp đƣợc chọn là đệm phosphat pH = 3 cho các khảo sát tiếp theo.
3.3.2.3. Khảo sát thành phần dung dịch rửa giải
Đối với chiết pha rắn, ngoài yếu tố cột thì thành phần dung môi rửa giải là yếu tố quan trọng nhất. Dung môi rửa giải và thể tích rửa giải quyết định đến việc rửa giải chất phân tích ra khỏi cột. Do đó, các yếu tố đó sẽ đƣợc khảo sát.
a, Khảo sát dung dịch rửa giải
Với đặc điểm là chất phân cực trung bình thì dung môi rửa giải cũng là các dung môi phân cực trung bình để tăng hiệu quả chiết. Trong nghiên cứu này, các dung môi đƣợc chọn làm dung môi rửa giải là ACN, MeOH, diclometan, etylacetat và hỗn hợp MeOH/diclometan (1:9). Tất cả các dung môi đƣợc rửa giải với thể tích là 5ml. Kết quả thu đƣợc trong hình sau:
56
Hình 3. 23: Sắc ký đồ của mẫu nước tiểu khi sử dụng các dung môi rửa giải khác nhau trong kĩ thuật chiết pha rắn
Từ hình trên có thể thấy rằng khi sử dụng dung môi rửa giải là ACN thì thu đƣợc tín hiệu của chất là tốt nhất (không bị dính chân với píc liền kề hay độ thu hồi là lớn). Điều này có thể giải thích do Levofloxacin là một chất phân cực gầngiống nhƣ ACN, do đó việc rửa giải gần nhƣ hoàn toàn, thêm nữa với các dung môi nhƣ diclometan hay MeOH khi dùng để rửa giải chất thì vô tình rửa giải cả các tạp chất gây đến hiện tƣợng dính chân píc. Do đó, dung môi rửa giải đƣợc chọn là ACN.
b. Khảo sát thể tích dung dịch rửa giải
Khi muốn tăng hiệu suất của quá trình chiết pha rắn thì thể tích dung môi rửa giải cũng là một lựa chọn đáng lưu ý. Khi tăng thể tích dung môi chiết tăng thì hiệu suất chiết cũng tăng, tuy nhiên, điều đó cũng làm thời gian cô đuổi dung môi tăng
57
và tốn khí cô đuổi. Do đó, các thể tích dung môi khảo sát đƣợc chọn là 3ml, 4ml, 5ml, 6ml và 7ml.
Sau giai đoạn hoạt hóa và cân bằng cột, đƣa 1,0ml mẫu thêm chuẩn có nồng độ Lev là 10ppm. Rửa giải cột theo các thể tích dung môi ACN đã lựa chọn để khảo sát. Cô cạn dung môi bằng cách thổi khí N2 và ở nhiệt độ 40oC sau đó hòa tạn cặn bằng pha động và xác định trên máy HPLC. Kết quả thu được thể hiện ở hình dưới đây:
Hình 3. 24: Ảnh hưởng của dung môi rửa giải đến độ thu hồi của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu theo quy trình chiết pha rắn
Từ số liệu thu đƣợc nhận thấy rằng khi càng tăng thể tích dung môi ACN thì hiệu suất thu hồi càng cao, nhƣng đến một lƣợng thể tích nhất định thì hiệu suất đó gần nhƣ không thay đổi nhiều (tại 5,6 và 7ml dung môi ACN). Và để tiết kiệm lƣợng dung môi khi chiết cũng nhƣ rút ngắn thời gian cô cạn dung môi thì thể tích dung môi để sử dụng cho chiết pha rắn là 5ml.
Nhƣ vậy quy trình chiết pha rắn tối ƣu
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
3ml 4ml 5ml 6ml 7ml
Hiệu suất thu hồi (%)
Thể tích dung môi (ml)
Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thể tích dung môi rửa giải
58
59
Hình 3. 25: Sắc ký đồ của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo theo quy trình chiết pha rắn đã tối ưu
3.3.2.4. Thẩm định phương pháp a. Độ đặc hiệu
Tiến hành phân tích mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn trên nền mẫu nước tiểu (không có chất phân tích). Sắc ký đồ phân tích trên hệ thống HPLC đối với mẫu trắng phải không cho tín hiệu tại thời gian lưu tương ứng với chất phân tích.
Kết quả so sánh mẫu nước tiểu thêm chuẩn với nền mẫu nước tiểu trắng như sau:
60
Hình 3. 26: Sắc kí đồ của Levofloxacin trong mẫu nước tiểu bằng kĩ thuật chiết pha rắn
Từ sắc ký đồ có thể thấy rằng khi chiết mẫu trắng (nước tiểu) rồi đem phân tích trên thiết bị HPLC thì không thấy sự xuất hiện pic tạp trùng với vị trí của chất phân tích Lev. Đường nền tại vị trí pic Lev cho tín hiệu thấp. Như vậy, phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu đáp ứng đƣợc yêu cầu.
b. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp
Với cách sử dụng cách xác định giới hạn phát hiện và giới hạn của phương pháp nhƣ mục 2.5.1 thì dựa vào tín hiệu S/N thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
MDL = 0,027ppm MQL = 0,09ppm
c. Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu nước tiểu theo quy trình chiết pha rắn
Pha dãy chuẩn Levofloxacin trong mẫu nước tiểu trắng có nồng độ từ 0,09ppm đến 100ppm. Tiến hành sắc ký nhƣ các điều kiện đã chọn. Kết qủa đƣợc ghi trong bản sau:
61
Bảng 3. 14: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng đồ Levofloxcin theo phương pháp chiết pha rắn
Nồng độ (ppm) Spic (mAu)
0,09 28813
0,5 106250
1 231907
2 426740
5 1081593
10 2153110
20 4199353
50 10457393
70 14556230
100 21398619
62
Hình 3. 27: Đường chuẩn của Levofloxacin theo phương pháp chiết pha rắn Chất phân tích trong nền mẫu nước tiểu có khoảng tuyến tính rộng từ 0,09ppm- 100ppm với hệ số tương quan R2 = 0,9999
Phương trình hồi quy của Levofloxacin có dạng:
Y = 207778X + 26100
Trong đó Y là diện tích pic, X là nồng độ Levofloxacin
Sử dụng phương pháp thống kê kiểm tra thấy Ftính< Fbảng nghĩa là sự sai khác giữa giá trị hệ số a không có sự khác nhau có nghĩa với giá trị 0 ở độ tin cậy 95%
hay phương pháp không mắc sai số hệ thống.
d. Đánh giá độ chụm của phương pháp
Để đánh giá độ chụm của phương pháp, chúng tôi tiến hành làm lặp lại 3 lần để khảo sát độ lặp lại của Levofloxacin ở mức nồng độ48,4ppm. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng sau:
y = 207778x + 26100 R² = 0,9999
0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000
0 20 40 60 80 100 120
Diện tích pic (mAu)
Nồng độ (ppm)
Đường chuẩn của Levofloxacin theo phương pháp chiết pha rắn
63
Bảng 3. 15: Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp chiết pha rắn
Lần chiết 1 2 3
Nồng độ Lev thêm chuẩn (ppm) 48,4 48,4 48,4 Nồng độ Lev thu hồi (ppm) 44,53 45,54 45,21
Hiệu suất thu hồi (%) 92,0% 94,1% 93,4%
RSD % 1,15%
Từ các kết quả trong bảng cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối RSD < 3% .Tức là mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh giá trị trung bình có thể chấp nhận được. Điều đó chứng tỏ rằng phương pháp chiết pha rắn có độ lặp lại tốt.
e. Đánh giá độ đúng của phương pháp
Để đánh giá độ đúng của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát chiết mẫu trắng đã thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ với quy trình chiết pha rắn tối ƣu nhƣ đã nêu trong mục 3.3.2.3-b. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng sau:
Bảng 3. 16: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp chiết pha rắn
Tên Mức 1 Mức 2 Mức 3
Nồng độ Lev chuẩn thêm (ppm) 19,36 48,4 96,8 Nồng độ Lev thu hồi (ppm) 17,99 45,54 90,70
Hiệu suất thu hồi (%) 92,9% 94,1% 93,7%
Hiệu suất thu hồi trung bình (%) 93,57%
Các kết quả ở bảng trên hiệu suất thu hồi của Levofloxacin khá cao từ, cho thấy phương pháp chiết pha rắn có độ đúng cao.
Từ các kết quả nghiên cứu thu đƣợc, chúng tôi thấy quy trình phân tích đã đáp ứng đƣợc các yêu cầu về độ chụm và độ đúng trong phân tích lƣợng vết các hợp chất hữu cơ trong nền mẫu phức tạp. Quy trình chiết chiết pha rắn có ƣu điểm nổi trội hơn chiết lỏng – lỏng là thời gian xử lý mẫu ngắn, độ thu hồi cao, khoảng tuyến tính rộng. Cả hai quy trình đều có độ lệch chuẩn tương đối của chất phân tích RSD
64
< 3%, độ thu hổi của chất phân tích từ 86,57% - 94,1% . Do đó, chúng tôi áp dụng cả hai quy trình chiết trên để phân tích các mẫu thực tế.