CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.2 Phân lập các hợp chất từ loài Xáo tam phân
Từ nghiên cứu sàng lọc hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình chuột gây độc gan bằng paracetamol cho thấy cao metanol và cao nước có tác dụng làm giảm men gan, bảo vệ gan. Với mục tiêu nghiên cứu thành phần hóa học có định hướng tác dụng sinh học, chúng tôi đã tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của 02 cao chiết có hoạt tính trên. Kết quả nghiên cứu cho thấy lớp chất chính của thân rễ cây Xáo tam phân là các coumarin và coumarin glycoside.
Thân rễ cây Xáo tam phân khô (5 kg) được nghiền thành bột mịn, ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng, 15 L x 3 lần, mỗi lần 3 ngày. Dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao chiết tổng. Cao chiết metanol tổng được thêm nước cất và chiết phân bố lần lượt bằng n-hexan, clorofoc, etyl axetat thu được dịch chiết hexan, dịch chiết clorofoc, dịch chiết etyl axetat và dịch nước. Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu các cao chiết tương ứng: hexan (PT-H, 24,6g), clorofoc (PT-C, 70g), etyl axetat (PT-E, 11,4g) và cao nước (PT-W, 158g).
Từ 24,6 g cao chiết hexan (PT-H) sắc ký cột pha thường với chất nhồi cột silica gel (40-63 àm) và hệ dung mụi rửa giải là hexan: axeton 1:1 thu được hai phân đoạn PT-H1 và PT-H2. Tiến hành sắc ký cột silicagel phân đoạn PT-H1 (10,4g) trong hệ dung môi hexan: axeton gradient, thu được hợp chất PT-1 (5,8 g). Phân đoạn PT-H2 (14,2 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan: axeton gradient, thu được 7 phân đoạn PT-H2A đến PT-H2G. Phân đoạn PT-H2D (3 g) được tiếp tục đưa trên cột pha đảo MYC với hệ dung môi axeton: nước 5:2,
thu được hợp chất PT-2 (500 mg). Tiếp tục phân lập phân đoạn PT-H2B (2 g) trên silicagel với hệ dung môi clorofoc: axeton 20:1, thu được hợp chất PT-3 (350 mg).
Phõn đoạn clorofom (PT-C, 70 g) đưa lờn cột silica gel (40-63 àm) với hệ dung môi rửa giải là diclometan : aceton gradient, thu được 6 nhóm phân đoạn PT- C1 đến PT-C2. Phânđoạn PT-C3 (2,8 g) tiến hành phân tách trên cột thường với hệ dung môi hexan : aceton = 4:1 thu được 8 phân đoạn PT-C3A đến PT-C3H. Phân đoạn PT-C3C (140 mg) được tiến hành sắc ký trên cột pha đảo YMC thu được hợp chất PT-4 (23 mg). Phân đoạn PT-C3D (535 mg) chạy sắc ký trên cột silicagel thường với hệ dung môi diclomethan:aceton thu được hợp chất PT-5 (5,4 mg). Tiếp tục chạy sắc ký cột phân đoạn PT-C3E (340 mg) trên cột pha đảo YMC thu được hợp chất PT-6 (16 mg). Từ phân đoạn PT-C3F (160 mg) được đưa trên cột siicagel thường với hệ dung môi hexan : aceton = 2 : 1, thu được hợp chất PT-7 ( 6mg).
Thân rễ cây Xáo tam phân khô (5 kg) được xay nhỏ, đem đun với nước ở 1000 C. Dịch nước (PR) được lọc bỏ cao và tiến hành chạy cột Diaion HP-20, rửa giải với hệ dung môi H2O -MeOH thu được 5 nhóm phân đoạn tương ứng, ký hiệu PR1-PR5.
Phân đoạn PR5 (32.27 g) được tiến hành chạy sắc ký cột silica gel (40-63 àm) và rửa giải với hệ dung mụi CH2Cl2 : MeOH gradient thu được 5 nhúm phõn đoạn PR5A – PR5E. Phân đoạn PR5D (10 g) được tiếp tục chạy sắc kí cột silica gel (75-100 àm) và rửa giải với hệ dung mụi CH2Cl2 : MeOH : H2O = 4:1:0.1 thu được 5 phân đoạn từ PR5D1 đến PR5D5. Phân đoạn PR5D2 được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel pha đảo YMC với hệ dung môi axeton-nước 2:3 thu được hợp chất sạch PT-8 (28.8 mg). Phân đoạn PR5D3 được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel pha đảo YMC và giải hấp với hệ dung môi axeton-nước 2:3 thu được hợp chất sạch PT- 9(102 mg).
Phân đoạn PR4 (40.83 g) được tiến hành chạy sắc kí cột silica gel (40-63 àm), rửa giải với hệ dung mụi clorofoc : metanol = 4:1 thu được 7 phõn đoạn từ PR4.1 đến PR4.7. Phân đoạn PR4.3 được tiếp tục chạy sắc kí cột silica gel pha đảoYMC, rửa giải với hệ dung môi aceton: nước = 3:1 thu được hợp chất PT-10 (10 mg).
Sơ đồ 3. 1. Phân lập các hợp chất từ cao metanol loài Xáo tam phân
Sơ đồ 3. 2. Phân lập các hợp chất từ cao nước của loài Xáo tam phân
*Tính chất vật lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập từ thân rễ cây Xáo tam phân
Hợp chất PT-1: ostruthin, bột màu trắng, ESI-MS (+): m/z 299.4 ([M+H]+).
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR(125MHz, CDCl3) δ (ppm) xem Bảng 4.7 Hợp chất PT-2 (chất mới): ninhvanin, bột màu vàng nhạt, 6-(3,7-Dimethyl- 2,6-octadienyl)-7-hydroxy-8-methoxy-2H-1-benzopyran-2-one, ESI-MS (+): m/z 326.2 [M+H]+, HR-ESI-MS (+): m/z 329.17459 [M+H]+, 1H-NMR (500 MHz, MeOH-d4) và 13C-NMR (125MHz, MeOH-d4) xem Bảng. 4.8
Hợp chất PT-3: 6-(2-Hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran, dầu màu vàng nhạt, ESI-MS (+): m/z 204.9 [M+H]+, 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), 13C- NMR (125MHz, CDCl3) xem Bảng.4.9
Hợp chất PT-4: citrusinine-I, bột màu trắng, HR-ESI-MS (+): m/z 302.1072 [M+H]+, 324.0878 [M+Na]+., 1H-NMR (500 MHz, MeOH -d4, TMS) và 13C-NMR (125 MHz, MeOH -d4, TMS) xem Bảng 4.10
Hợp chất PT-5 (chất mới): paramitrimerol, bột màu trắng, [α]25−8.7 (c 0.20, D
(C14H15O3, 231.1021), 1H-NMR (500 MHz, Aceton - d6) và 13C-NMR (125 MHz, Aceton - d6) xem Bảng.4.11
Hợp chất PT-6: 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7- hydroxycoumarin, bột màu trắng, HR-ESI-MS(+): m/z 315.1609 [M+H]+. C19H22O4,
1H-NMR (500 MHz, MeOH-d4) và 13C-NMR (125 MHz, MeOH-d4) xem Bảng.4.12 Hợp chất PT-7 (chất mới) : ninhvanin B, bột màu trắng ngà, [α]25D +6.0 (c 0.1, MeOH); IR (KBr) cm-1: 3355, 3218, 3137, 2893, 1667, 1592, 1369, 1232, 1144, 1043, 876; UV max (MeOH): 334 nm; HR-ESI-MS (m/z): 337.1438 [M+Na]+ (C19H22O4Na, 337.1416), 1H-NMR (500 MHz, CD3Cl3) và 13C-NMR (125 MHz, CD3Cl3) xem Bảng.4.13
Hợp chất PT-8 (chất mới): paratrimerin A, bột màu trắng, IR (KBr) cm-1: 3379, 2935, 1646, 1088, 990, 746, 660, 514. UV max (MeOH): 204, 256, 292, 330 nm. [α]D25 - 25.0o(c 0.02, MeOH). HR–ESI–MS (+) (m/z): 781.2691 [M+H]+, 803.2548 [M+Na]+, 457.1637 [M– C12H20O10+H]+, C40H44O16. Phổ 1H-NMR (500 MHz, Aceton - d6) và Phổ 13C-NMR (125 MHz, Aceton - d6) xem Bảng 4.14
MeOH); UV λmax
Hợp chất PT-9 (chất mới): paratrimerin B, bột màu ngà, HR-ESI-MS (+): m/z 913.3101 [M+H]+, 935.2965 [M+Na]+. LC-HR-ESI-MS: 913.3145 [M+H]+. C45H52O20. 1H-NMR (500 MHz, Aceton - d6) và 13C-NMR (125 MHz, Aceton - d6) xem bảng 4.15.
Hợp chất PT-10: parabacunoic acid, bột màu trắng, HR-ESI-MS (m/z):
637.2780 [M + H]+ (calcd. for C32H45O13, 637.2860), 659.2571 [M + Na]+ (C32H44O13Na, 659.2679), 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, TMS) và 13C-NMR (125MHz, CD3OD, TMS) xem Bảng 4.18