CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ
4.1 Sàng lọc tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn
4.1.1 Sàng lọc tác dụng kháng virus viêm gan B in vitro
Kháng nguyên bề mặt HBsAg là đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành lên hạt virus HBV, xâm nhiễm vào tế bào gan và ngăn cản hệ thống miễn dịch của cơ thể với virus HBV. Vì vậy, một trong các tiêu chí đánh giá khả năng kháng HBV là dựa vào mức độ ức chế sản sinh HBsAg.
Việc đánh giá tác dụng kháng virus viêm gan B trên dòng HepG2.2.15 nhiễm HBV của một số mẫu cao chiết của cây Nhó đông và Xáo tam phân được tiến hành qua 2 bước: 1-Đánh giá mức độ ảnh hưởng tới sự sống tế bào trên dòng HepG.2.2.15, 2 -Đánh giá mức độ biểu hiện HBsAg đối với các mẫu ít gây độc tế bào (độ sống sót trên 80%) ở bước 1.
4.1.1.1 Đánh giá mức độ ảnh hưởng tới sự sống tế bào HepG2.2.15
Để đánh giá mức độ ảnh hưởng tới sự sống tế bào, tế bào được nuôi cấy ở nồng độ 4x104 trong đĩa 96 giếng. Sau đó tiến hành thử thuốc ở nồng độ 30μg/ml. Sau 48 giờ thử thuốc, cho thấy tỷ lệ % sống sót của tế bào HepG2.2.15 ở các mẫu thử như sau:
Bảng 4. 1. Ảnh hưởng tới sự sống tế bào HepG2.2.15 của các cao chiết
stt Ký hiệu Loài Mẫu Giá trị OD % sống sót
1 Mẫu trắng 0,049
2 DMSO , 0,805333 100
3 PT P. trimera cao chiết MeOH
0,92 114,23
4 PR P. trimera cao nước
0,7995 99,27
5 P. trimera phân đoạn
PR1 dianion của cao
nước 0,811 100,70
6 P. trimera phân đoạn
PR2 dianion của cao
nước 0,832 103,31
7 P. trimera phân đoạn
PR3 dianion của cao
nước 0,895 111,13
8 P. trimera phân đoạn
PR4 dianion của cao
nước 0,8055 100,02
9 P. trimera phân đoạn
PR5 dianion của cao
nước 0,192 23,84
10 ML M. longissima EtOH extract 0,86 102,25
11 W M. longissima cao chiết nước 0,82 107,28
Các số liệu từ bảng 4.1 cho thấy 06 cao chiết từ loài Xáo tam phân và 02 cao từ loài Nhó đông ít gây ảnh hưởng tới sự sống tế bào HepG2.2.15 với tỷ lệ sống sót trên 80% (khoảng từ 90,76 - 125,97%). Ngoại trừ, phân đoạn PR5 của cao nước loài Xáo tam phân thể hiện độc tính mạnh với tỷ lệ sống sót đạt 23,8%. Các mẫu ít gây độc trên tế bào được tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng tới khả năng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg với đối chứng dương là Lamivudine.
4.1.1.2 Đánh giá mức độ biểu hiện HBsAg
Tiến hành đánh giá mức độ biểu hiện HBsAg của 6 mẫu thử từ rễ cây Xáo tam phần và 2 mẫu thử từ cõy Nhú đụng ở cỏc nồng độ 60 àg/ml cựng với đối chứng dương lamivudine ở nồng độ 50μM cho kết quả tại bảng sau.
Bảng 4. 2. Đánh giá mức độ biểu hiện HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 của các cao chiết
stt Loài Phân đoạn Giá trị OD Mức độ biểu
Ký hiệu Nồng độ SE hiện HBsAg (
(450nm) %)
1 Mẫu trắng 0,190 0,140 0
2 DMSO 0 àM 1,228 0,016 100
3 Lamivudine 50 àM 0,635 0,022 42,86
4 PT P. trimera cao chiết 60 àg/ml 1,351 0,026 111,88
MeOH
5 PR P. trimera cao nước 60 àg/ml 1,647 0,066 140,37
6 P. trimera phân đoạn
PR1 dianion của 60 àg/ml 1,393 0,011 115,89
cao nước
7 P. trimera phân đoạn
PR2 dianion của 60 àg/ml 1,406 0,016 117,19
cao nước
8 P. trimera phân đoạn
PR3 dianion của 60 àg/ml 1,310 0,035 107,93
cao nước
9 P. trimera phân đoạn
PR4 dianion của 60 àg/ml 1,269 0,014 103,98
cao nước
10 ML M. longissima EtOH extract 60 àg/ml 0,91 0,028 69,37
11 W M. longissimacao chiết nước 60 àg/ml 1,051 0,06 85,04
Các số liệu của bảng 4.2 cho thấy 06 mẫu cao từ loài Xáo tam phân không có khả năng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg (có % biểu hiện trong khoảng 103.98 đến 140.37%) cao hơn mẫu đối chứng âm DMSO (có % biểu hiện là 100%). Ngược lại, các cao etanol và nước từ cây Nhó đông có thể hiện tác dụng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg có % biểu hiện tương ứng là 69,37, 85,04%. Đối chứng tham khảo Lamivudine chỉ cho thấy mức biểu hiện HBsAg là 42,86%.
4.1.1.3 Đánh giá giá trị IC50 làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg
Cao etanol (ML) và cao nước (W) của cây Nhó đông được tiếp tục đánh giá IC50 làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg.
Bảng 4. 3. Giá trị nồng độ IC50 của hai cao chiết tổng
Nồng độ Abs 450 SE Ức chế (%) IC50 (μg/ml)
Mẫu trắng 0,071 0,007 0
DMSO 0 àM 1,911 0,018 100
Lamivudine 50 àM 0,905 0,040 45,30 19,92±0,18
ML 15 àg/ml 1,856 0,001 97,02
30 àg/ml 1,754 0,081 91,48 146,90±30,17
60 àg/ml 1,567 0,129 81,31
7,5 àg/ml 1,966 0,000 102,98
W 7,5 àg/ml 1,917 0,008 100,34
15 àg/ml 1,894 0,038 99,09 297,76±58,14
30 àg/ml 1,843 0,028 96,29
60 àg/ml 1,841 0,107 90,77
Cao tổng etanol (ML) và cao nước (W) của thân và rễ loài Morinda longissima có tác dụng kháng HBV trên in vitro. Tuy vậy, tác dụng ức chế sự tiết ra HBsAg trên dòng HepG2.2.15 của loài Nhó đông thấp hơn một số cặn chiết của cây thuốc của Trung Quốc như Boehmeria nivea (Linn.) Gaudich, Polygonum cuspidatum, Stellaria media (L.) Vill., Ligularia atroviolacea, Radix Astragali, Oenanthe javanica [108]. Trong một nghiên cứu khác, cao chiết cồn thân rễ cây Nhó đông và một số phân đoạn khác thể hiện tác dụng kháng HBV trên mô hình in vitro trên dòng Hep3B, thông qua đánh giá sự làm hàm lượng HBsAg và nồng độ HBV-DNA [109-110].
Từ các kết quả trên cho thấy 02 cao chiết rễ cây Nhó đông có tác dụng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg trên in vitro. Tuy nhiên, các mẫu cao từ loài Xáo tam phân chưa thể hiện tác dụng tác dụng này. Đây là một phát hiện mới trong nghiên cứu tác dụng sinh học của hai cây thuốc chữa bệnh gan này.
Do vậy, các cao trên được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học (cụ thể mục 4.3).