CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.3 Phân lập các hợp chất từ thân rễ loài Nhó đông
Từ kết quả sàng lọc hoạt tính kháng HBV trên dòng tế bào HepG2.2.15 cho thấy cao cồn và cao nước có tác dụng ức chế biểu hiện của HBsAg. Do vậy, cả hai cao trên được nghiên cứu về thành phần hóa học. Kết quả nghiên cứu cho thấy lớp chất chính của rễ cây Nhó đông là các anthraquinone, anthraquinone glucoside, phenylethanoid glucoside.
Thân rễ cây Nhó đông (4,5 kg) được ngâm chiết kiệt với etanol 96 độ (3 lần x 20L), thu được dịch chiết cồn. Dịch chiết cồn được chiết phân bố với etyl acetat thu được cao phân bố etyl acetat (ML-E) và cao phân bố nước (ML-W).
Cao etyl acetat (ML-E, 68g) được phân tách bằng sắc ký cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi gradient CH2Cl2 : MeOH (100:0 – 1:1) thu được 9 phân đoạn (ML-E1 đến ML-E9). Phân đoạn ML-E2 tiếp tục phân tách trên sắc ký cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (25:1) thu 4 phân đoạn (ML-E2A–ML-E2D) và hợp chất ML-8 (5,5g). Phân đoạn ML-E2A được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel với hệ dung môi hexan: EtOAc (8:1) thu được hợp chất ML-1 (19,8 mg). Phân tách tiếp phân đoạn ML-E2C trên sắc ký cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (20:1) thu được hợp chất ML-2 (6,5 mg).
Phân đoạn ML-E5 tiếp tục phân tách trên sắc ký cột silicagel với hệ dung môi EtOAc : MeOH (15:1) thu được 3 phân đoạn (ML-E5A-ML-E5C). Phân đoạn ML-E5B tiếp tục cho chạy qua sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH : H2O (5:1) thu được hợp chất ML-3 (5,1 mg).
Phân đoạn ML-E6 được tiến hành phân tách trên sắc ký cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 : EtOAc (7:1) thu được 4 phân đoạn (ML-E6A– ML-E6D). Phân
đoạn ML-E6B được tinh chế bằng sắc ký cột silicagel sắc ký cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi MeOH : H2O (4:1) thu được hợp chất ML-4 (7,0 mg). Trong khi đó phân đoạn ML-E6C lại được phân tách trên sắc ký cột silicagel với hệ dung EtOAc : MeOH (12:1) thu được hợp chất ML-5 (8,1 mg).
Phân đoạn ML-E8 được tiến hành phân tách trên sắc ký cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH : H2O (25 : 1 : 0,5) thu được 3 phân đoạn (ML-E8A – ML-E8C). Phân đoạn ML-E8A tiếp tục cho chạy qua sắc ký cột silicagel với hệ dung môi hexan : EtOAc (5:1) thu được hợp chất ML-6 (8,0 mg). Còn phân đoạn ML-E8C được tinh chế bởi sắc ký cột silicagel với hệ dung CH2Cl2 : EtOAc (9:1) thu được hợp chất ML-7 (5,6 mg).
Từ cao phân bố cao nước (ML-W, 107g) được đưa lên cột Dianion HP-20 với hệ dung môi rửa giải MeOH: H2O gradient, thu được 04 phân đoạn ML-W1 đến ML-W4.
Từ phân đoạn ML-W1 được tiến hành chạy sắc ký trên cột silicagen bằng hệ clorofoc: metanol gradient, thu được 6 phân đoạn ML-W1A đến ML-W1F. Kết tinh phân đoạn ML-W1E bằng metanol, thu được hợp chất ML-14 (5,3 mg). Phân đoạn MLW1D được tiếp tục chạy sắc ký silicagen bằng hệ etyl acetat : metanol (6/1), thu được hợp chất ML-13 (15 mg).
Phân đoạn ML-W2 được đưa lên sắc ký cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi clorofroc: metanol: nước 3:1:0.1 thu được 6 phân đoạn MLW2A đến MLW2F.
Phân đoạn MLW2A được tiếp tục chạy sắc ký cột silicagel bằng hệ clorofoc:
metanol: nước 6:1: 0,1 thu được hợp chất ML-12 (70 mg). Phân đoạn MLW2C được đưa lên sắc ký cột silicagel rửa giải bằng hệ clorofroc: metanol: nước 3:1: 0,1, thu được 6 phân đoạn MLW2C1đến MLW2C6. Phân đoạn MLW2C4 được tiếp tục chạy sắc ký pha đảo RP18 trên hệ metanol : nước 1,5 : 1, thu được hợp chất sạch ML-11 (23 mg).
Phân đoạn ML-W3 được đưa lên sắc ký cột silicagel hệ clorofoc : metanol = 15 : 1, thu được 8 phân đoạn ML-W3A đến ML-W3H, kết tinh phân đoạn ML-W3D thu được hợp chất ML-10 (20 mg). Tinh chế phân đoạn ML-W3A bằng silicagel với hệ n-hexan:ethylacetat 15:1, thu được hợp chất ML-9 (21 mg).
Thân rễ cây nhó đông (1 kg) được tiến hành chiết nóng với nước (3L x 5 lần)
, sau dịch chiết được tiến hành cô,thu được cao chiết nước.
Cao nước được chạy sắc ký nhanh với hệ metanol : nước gradien thu được 5 phân đoạn (W1-W5). Phân đoạn chạy 50% nước/50% metanol (W3)được tiếp tục chạy sắc ký nhanh trên cột pha đảo RP18, bằng hệ metanol : nước 1:3 đến 5:1, thu được 12 phân đoạn W3.1 đến W3.12.
Phân đoạn W3.1 được sắc ký pha đảo RP18 bằng hệ metanol: nước 1: 4 đến 3:1, thu được 8 phân đoạn W3.1A đến W3.1H. Tiếp tục phân đoạn W3.1B được tiếp tục chạy sắc ký cột pha đảo trên máy sắc ký nhanh ở bước sóng 210 nm trên hệ metanol:nước 25:75 đến 65:35 thu được hợp chất ML-15 (20 mg) và hợp chất ML- 16(12 mg) và hợp chất ML-22 (15 mg). Phân đoạn W3.1D được tiếp tục chạy sắc ký cột pha đảo trên máy sắc ký nhanh ở bước sóng 210nm trên hệ metanol:nước 25 : 75 đến 70 : 30 thu được hợp chất ML-17 (23 mg). Phân đoạn W3.1E được tiếp tục chạy sắc ký cột pha đảo trên máy sắc ký nhanh ở bước sóng 210 nm trên hệ metanol : nước 30 : 70 đến 65-35 thu được hợp chất ML-18 (30 mg) và ML-19 (10 mg).
Phân đoạn W3.1H được tiếp tục chạy sắc ký cột pha đảo trên máy sắc ký nhanh ở bước sóng 210 nm trên hệ metanol:nước 30:70 đến 65:35 thu được hợp chất ML-20 (19,3 mg) và hợp chất ML-21 (22 mg).
Sơ đồ 3. 3. Qui trình phân lập các hợp chất từ cao etanol thân rễ cây Nhó đông
(4,5kg)
chiết EtOH x 3
Cao EtOH
chiết phân bố EtOAc x 3 lần
ML-E (68g) ML-W (107g)
CC, SiO2, C:M = 100:0→1:1, v/v
ML-E1 ML-E2 (15g) ML-E3 ML-E4 ML-E5 ML-E6 ML-E7 ML-E8ML-E9
CC, SiO2, C:M = 25:1, (4,5g) (6,4g) (3,9 g) CC, HP-20,
CC, SiO2, CC, SiO2, CC, SiO2, M:W= 0:1→1:0, v/v
ML-8 ML-11 ML-2 E:M = D:E = 7:1, v/v D:M:W=
(5,5g) 19,8 mg 6,5 mg 25:1, v/v 25:1:0,5, v/v/v
ML-3 ML-6 ML-7
5,1 mg 8,0 mg 5,6 mg
ML-4 ML-5
ML-W1 (15,8g) ML-W2 (26,2g) ML-W3 (29,5g)ML-W4 (35,5g) 7,0 mg 8,1 mg
CC, SiO2, C:M= 15:1, v/v CC, SiO2, C:M= 15:1, v/v CC, SiO2, C:M= 1:0→0:1,
ML-10 ML-9
ML-14 ML-13
20 mg 21 mg
5,3 mg 15 mg
ML-12 ML-11
7,0 mg 23 mg
Sơ đồ 3. 4. Phân lập các hợp chất từ cao nước thân rễ cây Nhó đông
*Tính chất vật lý và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập từ cây Nhó đông
Hợp chất ML-1: Damnacanthal, Chất bột màu vàng nhạt. ESI-MS: m/z 281 [M-H]- (C16H10O5), 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) xem Bảng. 4.19
Hợp chất ML-2: Lucidin-ω-methyl ether, chất bột màu vàng cam. ESI-MS: m/z 282,9 [M-H]- (C16H12O5), 1H-NMR (MeOH- d4, 500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz, MeOH- d4) xem Bảng.4.20
Hợp chất ML-3: Soranjidiol, chất bột màu vàng cam (C15H10O4). 1H-NMR (500 MHz, MeOH- d4) và 13C-NMR (125 MHz, MeOH- d4) xem Bảng 4.21
Hợp chất ML-4: Morindone-5-methyl ether, chất bột màu vàng đậm. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): Bảng 4.22
Hợp chất ML-5: Rubiadin, chất bột vô định hình, màu vàng (C15H10O4).1H-NMR (500 MHz, MeOH- d4) và 13C-NMR (125 MHz, MeOH- d4) xem Bảng.4.23
Hợp chất ML-6: Rubiadin-3-methyl ether, tinh thể hình kim, màu vàng cam. ESI- MS: 269 [M+H]+ , 1H-NMR (500 MHz, MeOH- d4) và 13C-NMR (125 MHz, MeOH- d4) xem Bảng4.24
Hợp chất ML-7: Damnacanthol, tinh thể màu vàng. ESI-MS: m/z 283 [M-H]- (C16H12O5). 1H-NMR (500 MHz, MeOH- d4) và 13C-NMR (125 MHz, MeOH- d4) xem Bảng.4.25
Hợp chất ML-8: Morindone, chất bột màu vàng chanh. ESI-MS: m/z 270,7 [M+H]
+ (C15H10O5), 1H-NMR (DMSO - d6, 500 MHz) và 13C-NMR (DMSO- d6, 125 MHz) xem Bảng4.26
Hợp chất ML-9: 1-hydroxy-2-methyl-6-methoxy anthraquinone, chất màu vàng cam. CTPT C16H12O4 M=268. ESI-MS: m/z 269 [M+H]+ , 1H-NMR (MeOH- d4, 500 MHz): 13C-NMR (MeOH- d4, 125 MHz) xem Bảng.4.27
Hợp chất ML-10: Morindone-6-methyl ether, bột màu đỏ, CTTP C16H12O5. 1H- NMR (DMSO - d6, 500 MHz) và 13C-NMR (DMSO - d6, 125 MHz) xem Bảng4.28 Hợp chất ML-11: Morindone-6-O-β-D-gentiobioside, chất màu đỏ, CTPT C27H30O15.1H-NMR (DMSO, 500 MHz) và 13C-NMR (DMSO - d6, 125 MHz) xem Bảng.4.29
Hợp chất ML-12: Lucidin-3-O-β-D-primeveroside, bột màu đỏ, CTPT C26H28O14,
1H-NMR (DMSO- d6, 500 MHz): và 13C-NMR (DMSO - d6, 125 MHz) xem Bảng 4.30
Hợp chất ML-13: hợp chất mới (morinlongoside A), bột màu trắng, CTPT C27H36O13 , [ ]22D −1.34 (c=1.00, MeOH); UV λmax (MeOH): 235.0 nm; IR (KBr)
3368, 2943, 2862,1704, 1633, 1521, 1439, 1351, 1290, 1244, 1064, 1016 cm−1; HRESI-MS (+): m/z 649.2127 [M+Na]+ (C29H38O15Na 649.2109); 1H-NMR (MeOH-d4, 500 MHz) và 13C-NMR (MeOH-d4,125 MHz) xem Bảng.4.31
Hợp chất ML-14: hợp chất mới (morinlongoside B), bột màu trắng [ ]22D −1.32 (c=1.00, MeOH); UV λmax (MeOH): 235.0 nm; IR (KBr) νmax 3370, 2941, 2860,1701, 1635, 1521, 1440, 1290, 1245, 1065, 1017 cm−1; HRESI-MS (+): m/z 591.2049 [M+Na]+ (C27H36O13Na 591.2053), 1H-NMR (DMSO - d6, 500 MHz) và
13C-NMR (DMSO - d6,125 MHz) xem Bảng 4.32 νmax
Hợp chất ML-15: hợp chất mới (morinlongoside C), dạng lỏng không màu, CTPT C22H32O15,[ ]22D +0.48 (c=1.60, MeOH); UV λmax (MeOH): 236.0 nm; IR νmax 3371, 2956, 2843, 1652,1450, 1410, 1114, 1023 cm−1; HR-ESI-MS (+): m/z 559.1653 [M+Na]+ (C22H32O15Na 559.1638);. 1H-NMR (MeOH-d4, 500 MHz): và 13C-NMR (MeOH-d4, 125 MHz) xem Bảng 4.33
Hợp chất ML-16: Geniposidic acid, hợp chất bột vô định hình, không màu, CTPT C16H22O10. 1H-NMR (MeOH-d4, 500 MHz) và 13C-NMR (MeOH- d4, 125 MHz) xem Bảng.4.34
Hợp chất ML-17: (3R)-3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D-glucopyranosyl]
-l-octen-3-ol, bột vô định hình, màu trắng, CTPTC19H33O10. 1H-NMR (MeOH- d4,, 500 MHz) và 13C-NMR (MeOH- d4,,125 MHz) xem Bảng.4.35
Hợp chất ML-18: Acteoside , chất rắn dạng bột màu vàng nhạt, C29H36O15, [α]25 D :−77.4 (c 0.31, MeOH), ESI-MS m/z: 647 [M+Na]+], 1H-NMR (CD3OD-d4, 400 MHz) và 13C-NMR (CD3OD-d4, 100 MHz) xem Bảng.4.36