Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp chuẩn bị các Biomix
Biomix được chuẩn bị dựa theo phương pháp của Fernández-Albertil và cs.
(2012) với một số cải tiến như thay than bùn bằng bã thải trồng nấm và bổ sung chủng nấm mốc phân huỷ lignin vào Biomix [16].
2.2.3.1. Chuẩn bị các Biomix
Các nguyên liệu chuẩn bị cho các Biomix (Hình 2.4) bao gồm:
33
a) b)
c) d) e) Hình 2.2: Các thành phần nguyên liệu của Biomix
a) Đất; b) Rơm; c) Than bùn; d) Bã thải trồng nấm sò;
e) Chủng nấm mốc phân hủy lignin được tuyển chọn (Penicillium chrysogenum) - Đất bề mặt được lấy trực tiếp từ vườn trồng rau màu ở Hà Đông, Hà Nội (ở độ sâu từ 0 - 20 cm). Sau khi mang về được xử lý bằng cách để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng rồi rây qua rây có đường kính lỗ 3 mm để đồng nhất mẫu. Bảo quản đất trong túi nilon sạch, bao kín ở nhiệt độ 4 - 10oC đến khi sử dụng.
- Rơm rạ được thu từ đồng ruộng đất chiêm trũng ở Ninh Bình. Rơm rạ phải chọn loại đã thật sự khô, sau khi mang về phòng thí nghiệm được xử lý sơ bộ để loại bỏ các tạp chất như túi nilon, sỏi, đá rồi sau đó cắt nhỏ rơm rạ thành những đoạn ngắn hơn có kích thước 2 - 3 cm để quá trình ủ được thực hiện dễ dàng và hiệu quả hơn trong việc khi hấp phụ và phân hủy HCBVTV của Biomix.
- Bã thải trồng nấm sò trắng (Pleurotus pulmonarius) được thu từ khu vực trồng nấm tại Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam - Bắc Từ Liêm - Hà Nội. Sau
34
khi mang về, bã nấm sò trắng được xử lý sơ bộ, sau đó nghiền nhỏ rồi rây qua rây có kịch thước lỗ 3 mm. Bảo quản trong túi nilon sạch, hút hết không khí, bao kín lại và để trong tủ ấm ở 4 - 10oC đến khi sử dụng.
- Than bùn sau khi mua về thì được bảo quản trong túi nilon sạch, bao kín và để trong tủ ấm ở nhiệt độ 4 - 10oC đến khi sử dụng.
- Nấm mốc phân hủy lignin (Penicillium chrysogenum) sau khi được tuyển chọn thì cho vào môi trường PDA dịch thể với các thành phần bao gồm:
Khoai tây : 200 gam Glucose : 20 gam Agar : 20 gam Nước cất : 1000ml pH : 5 - 5,5.
Sau khi cấy, nuôi lắc 120 vòng/phút trong vòng 6 - 7 ngày ở 30°C. Thu sinh khối trong bình và tiến hành bổ sung vào Biomix với tỷ lệ 5% thành phần Biomix (tương ứng với 125 ml). Trộn đều để nấm có thể phát triển đều trong Biomix.
2.2.3.2. Phối trộn tạo các Biomix
- Chuẩn bị ba thùng xốp loại vừa có kích thước trong 45 x 32 x 28 (cm) và ba nắp thùng hoặc tấm nilon để đậy, tấm đập sẽ được làm thủng vài lỗ nhỏ tạo không khí cho Biomix cũng như tạo điều kiện cho VSV hiếu khí sinh trưởng và phát triển.
- Các thành phần nguyên liệu được đưa vào theo thứ tự rơm, bã thải trồng nấm sò (hoặc than bùn đối với Biomix 3), đất sau đó phối trộn đều để chuẩn bị tạo các Biomix.
- Khối lượng của một loại Biomix là 2,5 kg.
+ Biomix 1: 0,625 kg đất : 1,25 kg rơm : 0,625 kg bã thải trồng nấm sò : 125 ml dịch nuôi cấy chủng nấm mốc phân hủy lignin được tuyển chọn.
+ Biomix 2: 0,625 kg đất : 1,25 kg rơm : 0,625 kg bã thải trồng nấm sò.
+ Biomix 3: 0,625 kg đất : 1,25 kg rơm : 0,625 kg than bùn.
- Cân thành phần mỗi nguyên liệu của mỗi Biomix như trên, cho vào các thùng xốp đã được chuẩn bị từ trước, trộn đều các nguyên liệu với nhau. Sau đó, tưới nước
35
bằng cách phun sương để làm ẩm đến độ ẩm 60% cho cả ba Biomix và bảo quản ở nhiệt độ phòng. Các Biomix sau khi chuẩn bị xong (Hình 2.5).
Hình 2.3: Các thùng chứa các hỗn hợp Biomix hoàn chỉnh vừa tạo được 2.2.4. Phương pháp thu mẫu và xác định các đặc điểm lý hóa của các Biomix
Tiến hành thu mẫu sau giai đoạn ủ ban đầu tại các thời điểm 0 ngày, 15 ngày và 30 ngày. Mẫu được lấy ở 3 vị trí khác nhau của đống ủ: trên, giữa và dưới. Sau đó, trộn đều hỗn hợp được lấy để tạo một mẫu tổ hợp sử dụng cho các thí nghiệm phân tích các chỉ tiêu lý hóa và sinh học.
2.2.4.1. Phương pháp đo pH
Để đo pH của các Biomix, tiến hành cân 5 g mỗi loại Biomix, cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc đều, để yên 10 phút. Sau đó thực hiện phép đo pH của hỗn hợp bằng máy đo pH cực chọn lọc ion (Mettler Toledo).
2.2.4.2. Phương pháp đo độ ẩm
Độ ẩm của Biomix được xác định theo phương pháp khối lượng của TCVN 6648:2000 (ISO:11465:1993).
2.2.4.3. Phương pháp xác định hàm lượng chất hữu cơ
Hàm lượng chất hữu cơ trong Biomix được xác định theo phương pháp Walkley-Black [3]. Các bước thực hiện như sau:
Mỗi Biomix cân và lấy ra 0,1 g hỗn hợp đã được rây qua rây có lỗ 0,25 mm.
Tiếp theo, cho hỗn hợp vào bình tam giác loại 500 ml. Thêm 10 ml dung dịch K2Cr2O7
1N và thêm 20 ml H2SO4 đặc, lắc đều, để yên trong 30 phút. Thêm 200 ml nước cất.
Thêm 1 ml chỉ thị axit phenylanthranilic. Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch FeSO4
36
0,5N cho đến khi dung dịch có màu xanh lá cây. Tiến hành làm thí nghiệm với mẫu trắng (là mẫu không có chứa chất chuẩn).
Hàm lượng chất hữu cơ trong Biomix được xác định theo công thức sau:
C (%) = N × (V0 ─ V1)/a × 0,39 × K Trong đó:
N: là nồng độ đương lượng của muối FeSO4
V0: là thể tích muối FeSO4 dùng để chuẩn độ thí nghiệm mẫu trắng V1: là thể tích muối FeSO4 dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm a: là lượng mẫu lấy để phân tích
K: là hệ số chuyển đổi từ mẫu khô không khí sang mẫu khô tuyệt đối
0,39 = 3 × 10-3 × 100% × 1,3 với 3 là đương lượng gam của C; 1,3 là hệ số bù cho quá trình oxi hóa chưa hoàn toàn chất hữu cơ trong phương pháp này.
2.2.4.4. Phương pháp xác định Nitơ tổng số
Hàm lượng Nitơ tổng số được xác định theo TCVN 6498-1999 (ISO 11261- 1995) Chất lượng đất − Xác định nitơ tổng − Phương pháp Kendan (Kjeldahl) cải biên và xác định bằng phương pháp Kenđan [31]. Các bước tiến hành như sau:
Đầu tiên cân 0,1 g mỗi loại Biomix đã được rây qua rây lỗ 0,25 mm, cho vào bình Kenđan khô đặt hơi nghiêng trên bếp. Nhỏ thêm vào bình 5 ml H2SO4 đặc để vô cơ hóa mẫu, đậy bình bằng một chiếc phễu, đun trên bếp từ từ cho đến khi ngừng thoát khói trắng và thu được dung dịch trong suốt không màu. Lấy ra để nguội. Thêm 1 ml HClO4 15%. Đun đến khi trắng cặn. Chuyển toàn bộ dung dịch thu được vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch định mức. Để lắng qua đêm.
Hút 10 ml dung dịch đem cất ammoniac (NH3).
Chuẩn bị dung dịch hấp phụ NH3: Lấy 30 ml dung dịch axit boric (H3BO3) 3%
rồi cho vào bình tam giác loại 250 ml. Nhỏ vào bình 3 giọt chỉ thị Tasiro, sử dụng một lượng dư (khoảng 10 - 15 ml) kiềm mạnh NaOH 40% để cất trong vòng 5 phút.
Dung dịch hấp phụ NH3 sẽ chuyển sang màu xanh. Sau khi cất xong thì dùng dung dịch HCl 0,05 N để chuẩn độ đến khi thấy xuất hiện màu tím đỏ.
Tiến hành tương tự với mẫu trắng.
37
Công thức xác định hàm lượng Nito tổng số trong Biomix:
N (%) = (V1 ─ V2 ) × N × 0,0014 × 100/a Trong đó:
V1: là số ml HCl dùng để chuẩn độ mẫu phân tích V2: là số ml HCl dùng để chuẩn độ mẫu trắng N: là nồng độ đương lượng của HCl
0,0014: là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch axit chuẩn độ (axit clohydric 0,1 M hoặc axit sulfuric 0,05 M)
a: là khối lượng mẫu Biomix tương đương với thể tích dung dịch được lấy đem đi cất Nitơ.