Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của Biomix
2.2.6.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phân hủy lignin
Hoạt tính enzyme phân hủy lignin được xác định theo phương pháp thử nghiệm 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) và 3-dimethylamino benzoic acid (DMAB) được mô tả chi tiết ở Castillo và cs. (1994) [8].
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự oxy hóa cặp đôi MBTH và DMAB. Theo đó, hệ enzyme phân hủy lignin xúc tác hình thành nên một hợp chất có màu tím đậm với một độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 590 nm với sự hiện diện của MBTH, DMAB và MnSO4. Phản ứng được khởi đầu bằng việc thêm vào dung dịch H2O2. Các bước tiến hành của phương pháp này được mô tả như sau.
Chuẩn bị dịch chiết xuất enzyme theo thứ tự:
- Sử dụng bình tam giác để cân 10 g (trọng lượng khô) mẫu của mỗi Biomix.
- Dung dịch đệm 100 mM succinate-lactate được thêm vào với 50 mL.
- Lắc đều bình tam giác ở 100 vòng/phút trong 2 giờ.
- Thu 10 mL dịch nổi, ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 20 phút và sau đó lọc qua màng lọc 0,45 àm.
Tiến hành phản ứng: Phản ứng chứa tổng thể tích là 2 mL bao gồm:
+ Dung dịch 6,6 mM DMAB: 300 àL + Dung dịch 1,4 mM MBTH: 100 àL + Dung dịch 20 mM MnSO4: 30 àL
+ Dịch chiết enzyme trong dung dịch đệm 100 mM succinic/lactic acid (pH 4,5): 1560 àL
+ Dung dịch 10 mM H2O2: 10 àL
Phản ứng màu được đo ở bước sóng 590 nm trên máy đo quang phổ với cuvet có đường kính là 1 cm.
Công thức tính hoạt độ enzyme:
Hoạt độ enzyme (đơn vị/ml) = (ΔAbs/phút) x (0,002/0,053) x số ml mẫu.
(Một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme mà oxy hoỏ được 1 àmol cơ chất trong 1 phút.)
39 Trong đó:
+ ΔAbs: là sự thay đổi về độ hấp thụ theo thời gian (phút).
+ 0,053: là hệ số hấp thụ mol của cơ chất tại bước sóng 590 nm + ε = 0,053 àM-1cm-1
Để đánh giá hoạt độ enzyme của các Biomix sau thời gian ủ 0 ngày, 15 ngày và 30 ngày, Biomix nào có hoạt độ mạnh hơn, tức là nhiều enzyme hơn. Từ đó sẽ xác định và chọn Biomix được có hoạt độ enzyme phân hủy lignin cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Đồng thời qua đó có thể so sánh Biomix 15 ngày ủ có bổ sung chủng nấm mốc phân hủy lignin với Biomix 15 ngày ủ không bổ sung nấm phân hủy lignin.
2.2.6.2. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật của Biomix
Số lượng VSV được xác định theo TCVN 6168:2002 thay thế cho TCVN 6168:1996.
- Nguyên tắc chung: Dựa trên phương pháp nuôi cấy trong môi trường thạch đĩa để xác định số lượng các tế bào sống của quần thể VSV bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc có trên thạch đĩa. Tiến hành pha loãng mẫu: sử dụng cối sứ đã được khử trùng để nghiền nát mẫu, cân 10 g mẫu rồi hòa vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí 0,85% vô trùng có độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng để đạt được nồng độ thích hợp.
- Tiến hành cấy mẫu: Để lấy ra 1 ml lượng mẫu từ các dịch mẫu có các nồng độ pha loãng ở trên cần dùng pipet đã được vô trùng riêng cho từng độ pha loãng, cấy vào 1 đĩa petri chứa môi trường thích hợp đã chuẩn bị sẵn. Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại 3 đĩa petri sau đó dùng que gạt vô trùng gạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ và thời gian tùy thuộc từng yêu cầu của mỗi loại VSV.
- Kết quả được tính bằng cách giữ lại các đĩa có chứa không quá 300 khuẩn lạc ở hai độ pha loãng kế tiếp nhau với điều kiện là một trong các đĩa này có chứa ít nhất 15 khuẩn lạc. Mật độ VSV trong một đơn vị kiểm tra được tính bằng CFU trên gam (CFU/g).
40 Công thức tính:
Trong đó:
N: là số VSV (được tính bằng CFU/g)
∑C: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri được giữ lại n1: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;
n2: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;
d: là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.
- Môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các nhóm VSV khác nhau:
+ Vi khuẩn: Môi trường nuôi cấy vi khuẩn là thạch - cao thịt - pepton có thành phần gồm: Cao thịt 5 g; Pepton 10 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L và pH 7; Nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong thời gian từ 2 - 3 ngày.
+ Xạ khuẩn: Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn là Gause có thành phần: Tinh bột tan 20 g; K2HPO4 0,5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; KNO3 1,0 g; NaCl 0,5 g; FeSO4.7H2O 1,0 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L; pH 7; Nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong 5 - 7 ngày.
+ Nấm mốc: Môi trường nuôi cấy nấm mốc là môi trường PDA có thành phần:
Khoai tây 200 g; Glucose 20 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L; pH 5 – 5,5; Nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong 3 - 5 ngày.
+ VSV phân hủy cellulose: Được nuôi cấy trong môi trường muối khoáng tối thiểu chứa CMC có thành phần: Na2HPO4 2,4 g; K2HPO4 2,0 g; NH4NO3 0,1 g;
MgSO4 0,01 g; CaCl2 0,01 g; CMC 1,0 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L. Nuôi cấy ở nhiệt độ 30°C trong vòng 3 - 5 ngày.
+ VSV phân hủy hemicellulose: Được nuôi ở môi trường muối khoáng tối thiểu chứa xylan có thành phần: Na2HPO4 2,4 g; K2HPO4 2,0 g; NH4NO3 0,1 g; MgSO4
0,01 g; CaCl2 0,01 g; Xylan 1,0 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L. Nuôi cấy ở 30°C, 7 ngày.
+ VSV phân hủy lignin: Chuẩn bị môi trường muối khoáng tối thiểu chứa lignin (MSM-L) có thành phần: Na2HPO4 2,4 g; K2HPO4 2,0 g; NH4NO3 0,1 g; MgSO4 0,01 g; CaCl2 0,01 g; Lignin 1,0 g; Agar 15 g; Nước cất 1 L. Nuôi cấy ở 30°C, 7 ngày.
1 2
(n 0,1.n ) N C
= d
ồ+
41
2.2.6.3. Phương pháp đánh giá hô hấp vi sinh vật của Biomix
Hô hấp của VSV được đánh giá bằng phương pháp đo lượng khí CO2 tạo ra trong vòng 24 giờ [27].
Cách tiến hành: Với mỗi mẫu Biomix đã ủ 15 ngày, lấy ra 30 g cho vào cốc đong 500 ml. Hút 10 ml dung dịch kiềm NaOH 1M vào cốc đong 100 ml. Đặt cả 2 cốc vào 1 bình nhựa, thêm 1 cốc đựng 10 ml nước cất vào bình để duy trì độ ẩm rồi đậy chặt bình. Để trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ phòng 25°C. Sau đó dùng dung dịch HCl 1M để chuẩn độ NaOH 1M dư với chỉ thị phenolphthalein đến khi màu chuyển từ hồng sang không màu để xác định lượng CO2 do VSV sinh ra. Ngưng quá trình chuẩn độ và ghi lại thể tích đã tiêu tốn.
- Tiến hành làm mẫu trắng với bình không chứa Biomix.
- Kết quả được tính như sau: Lượng CO2 sinh ra trong các Biomix được tính theo công thức:
Trong đó:
+ V1: là thể tích HCl 1M dùng để chuẩn độ mẫu trắng.
+ V2: là thể tích HCl 1M dùng để chuẩn độ mẫu (từ trong bình chứa Biomix).
+ CM HCl: là nồng độ mol của dung dịch HCl.
+ 44: là khối lượng phân tử của CO2.
+ : là hệ số quy đổi từ 30 g mẫu tươi làm thí nghiệm sang 100 g Biomix.