CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số tối ưu cho từng nội dung nghiên cứu
2.3.2.1. Nghiên cứu sơ chế rong nho nguyên liệu a. Công đoạn rửa rong nho
Mục đích của thí nghiệm là tìm ra các thông số thích hợp về lượng nước rửa, thời gian ngâm rửa và số lần rửa nhằm loại bỏ tối đa các tạp chất bám trên rong nhưng vẫn
đảm bảo chất lượng của rong với chi phí sản xuất thấp nhất. Hai chỉ tiêu được dùng để đánh giá công đoạn này là tổng số vi khuẩn hiếu khí và chất lượng cảm quan của rong nho sau khi rửa.
Xác định lượng nước rửa thích hợp
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định lượng nước rửa rong nho thích hợp Cách tiến hành: Rong nho sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó phân loại, lựa chọn những thân đứng có kích thước > 6cm, rong có màu xanh lục đặc trưng, không bị dập nát, hạt rong không bị vỡ và có độ đồng đều về kích thước. Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 5 kg rong nho tươi, rửa bằng nước biển sạch với tỷ lệ nước rửa so với nguyên liệu rong khác nhau: 5/1, 10/1, 15/1, 20/1 và 25/1 với thời gian rửa cố định 5 phút, quá trình rửa được thực hiện bằng tay ở nhiệt độ
Xác định lượng nước rửa thích hợp
5 10 15 20 25
Rong nho nguyên liệu
Rửa rong
(Lượng nước rửa: 5-25 lít/kg)
Đánh giá CLCQ và TSVKHK của rong nho
phòng (280C±20C). Sau khi rửa tiến hành lấy mẫu đánh giá chất lượng cảm quan và phân tích TSVKHK. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
Xác định thời gian ngâm rửa thích hợp
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian ngâm rửa rong nho thích hợp Cách tiến hành: Rong nho sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó phân loại, lựa chọn những thân đứng có kích thước >6 cm, rong có màu xanh lục đặc trưng, không bị dập nát, hạt rong không bị vỡ và có độ đồng đều về kích thước. Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm, mỗi mẫu 5 kg rong nho tươi, cố định lượng nước rửa thích hợp (kết quả thí nghiệm hình 2.3), quá trình rửa được thực hiện bằng
Xác định thời gian ngâm rửa thích hợp
5 6 7 8 9
Rong nho nguyên liệu
Rửa rong
(Thời gian ngâm rửa từ 5-9 Phút)
Đánh giá CLCQ và TSVKHK của rong nho
tay ở nhiệt độ phòng (280C±20C) với thời gian rửa 5 phút, 6 phút, 7 phút, 8 phút, 9 phút. Sau khi rửa tiến hành lấy mẫu đánh giá chất lượng cảm quan và phân tích TSVKHK. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
Xác định số lần rửa thích hợp
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định số lần rửa rong nho thích hợp Cách tiến hành: Rong nho sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm, sau đó phân loại, lựa chọn những thân đứng có kích thước >6 cm, rong có màu xanh lục đặc trưng, không bị dập nát, hạt rong không bị vỡ và có độ đồng đều về kích thước. Sau khi xác định được lượng nước rửa và thời gian rửa thích hợp (kết quả thí nghiệm hình 2.3, hình 2.4), tiếp tục xác định số lần rửa bằng cách cố định lượng nước rửa và thời gian rửa, thay đổi số lần rửa từ 1 đến 4 lần, thực hiện rửa bằng tay.
Sau đó, vớt rong ra, đánh giá chất lượng cảm quan và phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí còn lại trên rong làm cơ sở cho việc xác định số lần rửa thích hợp. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
Xác định số lần rửa thích hợp
1 2 3 4
Rong nho nguyên liệu
Rửa rong (Số lần rửa: 1 - 4 Lần)
Đánh giá CLCQ và TSVKHK của rong nho
b. Công đoạn nuôi lại (nuôi phục hồi trạng thái) rong nho nguyên liệu
Khi thu hoạch rong nho, thân đứng (cọng rong) bị cắt khỏi thân bò. Nên việc nuôi lại giúp rong lành vết cắt, mọc rễ và có thể sống bình thường.
Điều kiện môi trường phù hợp cho rong sinh trưởng, phát triển cũng là điều kiện phù hợp cho rong lành vết thương và mọc rễ. Theo kết quả nghiên cứu của các nhóm tác giả Nguyễn Xuân Hòa và cộng sự (2004), Nguyễn Hữu Đại và cộng sự (2006) cho thấy, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến độ sinh trưởng, phát triển của rong nho, như cường độ ánh sáng, nhiệt độ của môi trường, độ mặn, tỷ lệ rong trong môi trường nuôi, thời gian nuôi, lượng oxy hòa tan,.. Nhóm tác giả cũng cho rằng, độ mặn phù hợp cho rong sinh trưởng, phát triển là 30%o 33%o. Cường độ quang hợp của rong tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 280C300C [5], [13]. Trên cơ sở kế thừa các kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Xuân Hòa và Nguyễn Hữu Đại, trong công đoạn nuôi lại rong nho Luận án chỉ nghiên cứu ảnh hưởng về tỷ lệ rong trong môi trường nuôi, thời gian nuôi và lượng oxy hòa tan đến tỷ lệ rong lành vết thương và cường độ màu xanh lục của rong nho.
Xác định tỷ lệ rong trong môi trường nuôi
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ rong trong môi trường nuôi thích hợp Xác định tỷ lệ rong trong môi
trường nuôi thích hợp
1% 2% 3% 4% 5%
Nuôi phục hồi trạng thái (Thời gian nuôi: 3 ngày; Thay nước mỗi ngày; Tỷ lệ rong trong
môi trường nuôi: 1-5%)
Đánh giá tỷ lệ rong lành vết thương, cường độ màu xanh lục của rong
Rong nho nguyên liệu
Rửa rong trong điều kiện thích hợp
Cách tiến hành: Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm, cố định thời gian nuôi 3 ngày, mỗi ngày thay nước 1 lần, sục khí liên tục trong suốt thời gian nuôi (hàm lượng oxy hòa tan trong nước khoảng 6-10mg/l), nhiệt độ môi trường nuôi 280C±20C với tỷ lệ rong trong môi trường nuôi là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Sau đó tiến hành lấy mẫu đánh giá tỷ lệ rong lành vết thương và cường độ màu xanh lục của rong để chọn tỷ lệ rong trong môi trường nuôi thích hợp. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
Xác định thời gian nuôi
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi thích hợp
Cách tiến hành: Tiến hành 4 mẫu thí nghiệm với tỷ lệ rong trong môi trường nuôi thích hợp (kết quả sơ đồ hình 2.6), bơm sục khí liên tục trong suốt thời gian nuôi (hàm lượng oxy hòa tan trong nước khoảng 6-10mg/l), nhiệt độ môi trường nuôi 280C ± 20C và nuôi trong các thời gian khác nhau: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày và 4 ngày, mỗi ngày thay nước 1 lần. Kết thúc quá trình nuôi phục hồi, tiến hành lấy mẫu đánh giá tỷ lệ rong lành
Xác định thời gian nuôi thích hợp
1 2 3 4
Nuôi phục hồi trạng thái (Tỷ lệ rong nuôi thích hợp; Thay nước mỗi ngày; Thời gian nuôi: 1–4
ngày)
Đánh giá tỷ lệ rong lành vết thương và cường độ màu xanh lục của rong
Rong nho nguyên liệu
Rửa rong trong điều kiện thích hợp
vết thương và cường độ màu xanh lục của rong nho để chọn được thời gian nuôi thích hợp. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
Xác định hàm lượng oxy hòa tan
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng oxy hòa tan thích hợp Cách tiến hành: Tiến hành 4 mẫu thí nghiệm, nuôi phục hồi trạng thái trong môi trường có tỷ lệ rong/nước và thời gian nuôi thích hợp (kết quả sơ đồ ở hình 2.6; 2.7), nhiệt độ môi trường nuôi 280C±20C và nuôi trong điều kiện sục khí để tạo nồng độ oxy hòa tan từ 4 ÷ 10mg/l với bước nhảy là 2mg/l. Sau đó tiến hành lấy mẫu rong nho đánh giá tỷ lệ rong lành vết thương và cường độ màu xanh lục của rong nho để chọn được hàm lượng oxy hòa tan thích hợp. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
Xác định lượng oxy hòa tan thích hợp
6 8
Nuôi phục hồi trạng thái (Tỷ lệ rong nuôi thích hợp, thời gian nuôi thích hợp; Nồng độ oxy hòa
tan: 4-10mg/l)
Đánh giá tỷ lệ rong lành vết thương và cường độ màu xanh lục của rong
Rong nho nguyên liệu
Rửa rong trong điều kiện thích hợp
10 4
c. Tối ưu hóa công đoạn nuôi phục hồi rong nho
Khi xác định được khoảng thông số thích hợp cho quá trình nuôi phục hồi rong nho, bao gồm: tỷ lệ rong trong môi trường nuôi từ 2-3%; thời gian nuôi từ 2-3 ngày và lượng oxy hòa tan từ 6÷8 mg/l. Luận án tiến hành bố trí thí nghiệm theo phương pháp leo dốc của Box – Willson, chọn các yếu tố cố định như sau:
Các yếu tố cần tối ưu là tỷ lệ rong trong môi trường nuôi (%): U1 [2;3], thời gian nuôi (ngày): U2: [2;3] và lượng oxy hòa tan (mg/l): U3: [6;8]. Với hàm mục tiêu là tỷ lệ rong lành vết thương (Y1), với Y1 tiến đến maximum. Điều kiện không có hoặc có ít rong mọc thêm nhánh mới (Y2) <10% và cường độ màu xanh lục của rong (Y3)
>40%. Từ các yếu tố cần tối ưu, tiến hành bố trí quy hoạch thực nghiệm như sau:
Bảng 2.2. Ma trận quy hoạch thực nghiệm với các biến ảo của công đoạn nuôi rong phục hồi rong nho
Số TN U1 U2 U3 X1 X2 X3 X12 X13 X23 Y1 Y2 Y3
Số thí nghiệm
trong phương trình 2k
1 2 2 6 -1 -1 -1 1 1 1
2 3 2 6 1 -1 -1 -1 -1 1
3 2 3 6 -1 1 -1 -1 1 -1
4 3 3 6 1 1 -1 1 -1 -1
5 2 2 8 -1 -1 1 1 -1 -1
6 3 2 8 1 -1 1 -1 1 -1
7 2 3 8 -1 1 1 -1 1 1
8 3 3 8 1 1 1 1 1 1
Số thí nghiệm
ở tâm
9 2,5 2,5 7 0 0 0 0 0 0
10 2,5 2,5 7 0 0 0 0 0 0
11 2,5 2,5 7 0 0 0 0 0 0
Ghi chú:
Y1 Tỷ lệ rong lành vết thương (%) Y2 Tỷ lệ rong mọc thêm nhánh mới (%) Y3 Cường độ màu xanh lục của rong nho (%)
X1 Biến mã tỷ lệ rong trong môi trường nuôi (%) X2 Biến mã thời gian nuôi (ngày)
X3 Biến mã lượng oxy hòa tan (mg/l) Chọn phương trình hồi quy tuyến tính có dạng:
Y1 = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b12X1 X2 + b13 X1X3 + b23X2 X3 (2.1)
Sử dụng phần mềm Design Expert 8.0 đưa ra phương trình hồi quy, mô hình toán học và các biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng và mối tương quan giữa các yếu tố về mật độ rong nho, thời gian nuôi và lượng oxy hòa tan trong nước đến tổng điểm cảm quan của rong nho.
2.3.2.2. Nghiên cứu thiết kế thiết bị dùng nuôi phục hồi rong nho ở quy mô pilot, năng suất 1000 kg rong nho/mẻ
Mục đích nghiên cứu là tạo ra thiết bị sơ chế, nuôi phục hồi rong nho ở quy mô pilot trên cơ sở sử dụng kết quả nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm, hướng đến thương mại hóa sản phẩm và chuyển giao công nghệ cho một số cơ sở nuôi trồng và chế biến rong nho.
Nguyên lý làm việc của thiết bị phải đáp ứng được :
- Đặc tính cấu trúc mềm, dễ bị tổn thương cơ học của rong nho
- Thời gian nuôi phục hồi kéo dài (hơn 2 ngày) và trong thời gian nuôi rong tiếp tục sinh trưởng để lành vết thương nhờ các chất dinh dưỡng có sẵn trong nước biển tự nhiên và quá trình quang hợp.
- Thiết kế thiết bị có các thông số kỹ thuật, gồm nhiệt độ: +200C - +320C, nồng độ muối: 0 - 10%, nồng độ khí oxy hòa tan: 0 - 20mg/lít.
2.3.2.3. Nghiên cứu quá trình sơ chế, nuôi phục hồi rong nho ở quy mô pilot trên thiết bị đã thiết kế chế tạo
Mục đích của nghiên cứu là sử dụng kết quả nghiên cứu về điều kiện nuôi phục hồi trạng thái rong nho ở quy mô phòng thí nghiệm vào quy mô sản xuất pilot trên thiết bị đã thiết kế chế tạo. Từ đó điều chỉnh các thông số nuôi phục hồi rong nho phù hợp với điều kiện sản xuất pilot trên cơ sở đánh giá chất lượng và độ an toàn của rong nho sau khi nuôi nuôi phục hồi.
a. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi phục hồi đến chất lượng sản phẩm rong nho
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm có các nhiệt độ môi trường nuôi khác nhau: mẫu 1:
25±1oC, mẫu 2: 28±1oC, mẫu 3: 31±1oC (Điều chỉnh nhiệt đô môi trường thông qua hệ thống lạnh và điện trở gia nhiệt của thiết bị). Các mẫu nuôi cố định về cường độ ánh sáng từ 10.000 - 15.000lux thông qua hệ thống đèn led, nồng độ oxy hòa tan trung bình 7 - 8 mg/l thông qua hệ thống sục khí, tỉ lệ rong/nước biển là 2,5% và thời gian nuôi 3 ngày. Trong quá trình nuôi nước được chuyển động và lọc tuần hoàn liên tục.
Sau 3 ngày nuôi lấy mẫu đánh giá cảm quan, xác định hàm lượng vitamin C và một số thành phần hóa học cơ bản khác của rong nho để chọn được nhiệt độ môi trường nuôi thích hợp. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
b. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ oxy trong môi trường nuôi phục hồi đến chất lượng sản phẩm rong nho
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm có các nồng độ oxy hòa tan khác nhau: mẫu 1: 7 ± 0,5 mg/l, mẫu 2: 8 ± 0,5 mg/l, mẫu 3: 9 ± 0,5 mg/l. Các mẫu nuôi cố định cường độ ánh sáng từ 10.000lux – 15.000lux, nhiệt độ 28 ± 1oC, tỉ lệ rong/nước biển là 2,5%.
Trong quá trình nuôi nước được chuyển động và lọc tuần hoàn liên tục. Sau khi nuôi 3 ngày, lấy mẫu đánh giá cảm quan, xác định hàm lượng vitamin C và một số thành phần hóa học cơ bản của rong nho để chọn được nồng độ oxy hòa tan trong môi trường nuôi thích hợp. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
c. Bố trí ảnh hưởng của cường độ ánh sáng trong môi trường nuôi phục hồi đến chất lượng sản phẩm rong nho
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm được chiếu sáng với các cường độ ánh sáng khác nhau: mẫu 1: <10.000 lux, mẫu 2: 10.000 ÷ 15.000 lux, mẫu 3: >15.000 lux. Các mẫu được nuôi ở nhiệt độ 28±1oC, nồng độ oxy hòa tan 8±0,5mg/l, tỉ lệ rong/nước biển là 2,5%. Trong quá trình nuôi nước được chuyển động và lọc tuần hoàn liên tục. Sau khi
nuôi 3 ngày, lấy mẫu đánh giá cảm quan, xác định hàm lượng vitamin C và một số thành phần hóa học cơ bản của rong nho để chọn cường độ ánh sáng thích hợp trong môi trường nuôi. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
d. Bố trí ảnh hưởng lượng nguyên liệu trong môi trường nuôi phục hồi đến chất lượng sản phẩm rong nho
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm với số lượng khác nhau: 10 kg/m3, 20 kg/m3, 30 kg/m3, 40 kg/m3, và 50 kg/m3 (tương ứng tỷ lệ rong trong môi trường nuôi 1%, 2%, 3%, 4% và 5%). Tiến hành nuôi phục hồi rong trong nước biển có sục khí đạt nồng độ oxy 8
± 0,5 mg/ lít, cường độ sáng 10.000-15.000 lux, nhiệt độ 280C ± 10C, thời gian nuôi 3 ngày. Trong quá trình nuôi nước được chuyển động và lọc tuần hoàn liên tục. Theo dõi sự lành vết thương của rong nho, kết thúc quá trình nuôi khi các mẫu đạt được yêu cầu sau: tỷ lệ rong nho lành vết thương, ra rễ > 80%. Tất cả các thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của các lần lặp lại.
e. Bố trí ảnh hưởng của thời gian nuôi phục hồi rong nho đến chất lượng sản phẩm rong nho
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm với khối lượng rong nho cố định 20kg/m3, nồng độ oxy trong môi trường nuôi 8 ± 0,5mg/lít, cường độ ánh sáng 10.000-15.000 lux, nhiệt độ môi trường 280C ± 10C. Khảo sát thời gian nuôi phục hồi rong nho với các thời gian nuôi 1 ngày, 1,5 ngày, 2 ngày, 2,5 ngày và 3 ngày. Theo dõi sự lành vết thương của rong nho, kết thúc quá trình nuôi khi các mẫu đạt được yêu cầu sau: tỷ lệ rong nho lành vết thương, ra rễ > 80%, không có/có tỷ lệ rong ra nhánh ít (<10%), màu rong xanh sáng bóng. Sau đó, rong được vớt ra để ráo, kiểm tra chất lượng cảm quan, theo dõi thời gian bảo quản để lựa chọn thời gian nuôi phục hồi rong hợp lý cho quy trình.
2.3.2.4. Ly tâm tách bớt nước trên bề mặt rong nho
Mục đích của thí nghiệm: Kết thúc nuôi rong, hàm lượng nước bám trên bề mặt rong khá cao, nếu đem rong bao gói, bảo quản ngay, rong sẽ nhanh chóng úng, hư hỏng. Vì vậy, mục đích ly tâm rong nhằm loại bớt nước bám trên bề mặt rong, cọng rong khô ráo, hạn chế sự hư hỏng rong trong thời gian bảo quản.
Cách tiến hành: Qua khảo sát một số cơ sở sản xuất rong nho trên địa bàn Khánh
Hòa cho thấy, tốc độ ly tâm để tách nước trên bề mặt rong nho khá thấp, khoảng 300 ±100 vòng/phút, vì vậy chúng tôi cố định tốc độ ly tâm này. Thực hiện 3 mẫu thí
nghiệm, mỗi mẫu 1kg rong nho, khảo sát thời gian ly tâm 10s, 20s, 30s, 40s, 50s. Sau đó lấy rong đánh giá lượng nước tách ra và tỷ lệ rong bị dập để làm cơ sở cho việc chọn các thông số ảnh hưởng thích hợp.
2.3.2.5. Nghiên cứu bảo quản rong nho bằng phương pháp điều biến khí -MAP a. Đo cường độ hô hấp của rong nho
Đối với phương pháp bảo quản điều biến khí – MAP, việc lựa chọn bao bì thích hợp để bao gói nguyên liệu thực vật tươi là yếu tố thành công của phương pháp vì màng bán thấm của bao bì có liên quan trực tiếp đến cường độ hô hấp của thực vật tươi. Đối với những loại thực vật có cường độ hô hấp thấp thì chọn những bao bì có khả năng thấm khí thấp để bao gói và ngược lại [Theo Lisa Kitinoja et al, 2004] [20].
Vì vậy, đo cường độ hô hấp của rong nho là cơ sở để lựa chọn nhóm bao bì bao gói rong nho phù hợp nhằm kéo dài thời gian bảo quản rong nho. Cường độ hô hấp của rong nho được đo bằng máy đo cường độ hô hấp Illinois instrument, model 6600 của Đức, có độ chính xác rất cao (cảm biến CO2 có thể cài đặt được 0,00%).
Cách tiến hành: Lấy 250 gram rong nho đã nuôi phục hồi đưa vào thiết bị đo cường độ hô hấp là bình thủy tinh kín có một nút cao su. Sử dụng một đầu kim rỗng được kết nối từ máy đo hô hấp cắm vào nút cao su. Khi rong nho hô hấp sẽ sinh ra khí CO2 - lượng khí này sẽ hút từ bình chứa rong nho về máy và được đo tự động hiển thị trên màn hình. Thí nghiệm thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
b. Lựa chọn bao bì bao gói rong nho
Trên cơ sở xác định được cường độ hô hấp của rong nho, giả sử Luận án chọn các bao bì có tên BB1, BB2, BB3 để nghiên cứu. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn bao bì thích hợp theo quy trình sau: