KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
2.3. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
- Môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật bao gồm nhiều thành phần dinh dưỡng cần thiết khác nhau. Thành phần dinh dưỡng này tuỳ thuộc vào nhu cầu của từng loại vi sinh vật.
- Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân biệt, cấy chuyền, bảo quản, định danh vi sinh vật… Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, đạm, khoáng đa lượng và vi lượng… cần cho sự biến dưỡng về vật chất, năng lượng của đối tượng vi sinh vật quan tâm. Ngoài ra, môi trường cần có một hàm lượng nước thích hợp, có độ pH xác định và kết cấu thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mục tiêu.
- Mọi cơ thể sống đều được cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có cấu tạo từ các nguyên tố C, H, O và N gọi là các nguyên tố thiết yếu của sự sống. Nhìn chung các nguyên tố thiết yếu không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Ngoài các nguyên tố thiết yếu, trong các cơ thể vi sinh vật còn có các nguyên tố đa lượng như: S và P, các nguyên tố vi lượng như: Fe, Cu, Mg, Mn, Zn, K, Ca, Cl, Bo, I…Vì thế trong thành phần dinh dưỡng không thể cung cấp đơn thuần một số chất nào đó hoặc một nhóm nguyên tố nào đó mà trong tự nhiên, VSV sử dụng các nguồn dưỡng chất từ cơ thể thực vật, động vật hoặc VSV.
- Nồng độ đường phù hợp để nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn khoảng 0,05 – 0,20%, nấm mốc và nấm men khoảng 3 – 15%.
- Các chất tăng trưởng chủ yếu là các vitamin và các gốc kiềm purin, pirimidin, các acid béo, các thành phần của màng tế bào... Nồng độ thích hợp của các gốc kiềm purin, pirimidin cho vi sinh vật vào khoảng 5 – 20 g /ml. Nồng độ thích hợp của các vitamin vào khoảng 0,1 – 0,5 g/ml (1 g = 10-6 g )
Thành phần cơ bản chính màng xelluloza của tế bào vi khuẩn
21
Nguyên tố Dạng tồn tại cho vi sinh vật sử
dụng Thành phần trung bình (%)
C Chất hữu cơ
CO2
50
O Chất hữu cơ 20
N NH4+,NO3 - ,NO2- 14
H Chất hữu cơ 8
P H2PO42-, HPO42-, PO43- 3
2.3.1. Phân loại môi trường
Môi trường có thể được phân thành các loại khác nhau theo bản chất của thành phần của môi trường, theo tính chất vật lý và theo công dụng.
- Theo bản chất
- - Môi trường tự nhiên: có thành phần được sản xuất từ các sản phẩm có nguồn gốc động thực vật do vậy thành phần chính xác của môi trường là không xác định.
- - Môi trường tổng hợp: được điều chế từ các hoá chất tổng hợp tinh khiết với hàm lượng xác định
- - Môi trường bán tổng hợp: là môi trường tổng hợp mà trong thành phần của môi trường có bổ sung một số thành phần có nguồn gốc tự nhiên.
- Theo trạng thái vật lý
- - Lỏng (Broth): không chứa agar trong thành phần môi trường. Môi trường lỏng dùng để nuôi cấy tăng sinh, thử nghiệm đặc tính sinh lý, sinh hoá.
- - Rắn: trong thành phần môi trường có từ 20-25% agar. Môi trường rắn dùng để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc, định lượng mật độ vi sinh vật.
- - Bán lỏng (bán rắn): được dùng để lên men vi sinh vật trong công nghiệp - Theo mục đích
- - Môi trường tiền tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh không chọn lọc vi sinh vật. Ví dụ: nước pepton.
- - Môi trường tăng sinh: là môi trường lỏng dùng để tăng sinh chọn lọc đối tượng vi sinh vật cần kiểm nghiệm. Ví dụ: môi trường tetrathionate dùng tăng sinh chọn lọc Salmonella
- - Môi trường chọn lọc: là môi trường rắn dùng để phân lập chọn lọc các khuẩn lạc của vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân chọn lọc trong môi trường chọn lọc:
- + Chất kháng sinh (polymixin B, ampicillin, moxalactam, novobioxin, oxytetracycline, D-cycloserine, vancomycin, trimethiprim, cycloheximide);
- + Chất chỉ thị màu như brilliant green, sodium selenite, bile salts, potassium tellurite, sodium lauryl sulfate;
- + anaerobiosis bằng cách tạo điều kiện kỵ khí hoặc bổ sung những hóa chất ức chế quá trình hô hấp như sodium azide, potassium cyanide (ức chế vsv sinh catalase); phủ một lớp thạch lên trên mặt thạch (vd trong phân tích VK lactic);
- + pH, hoạt độ của nước, nhiệt độ.
- - Môi trường phân biệt :là môi trường rắn chọn lọc chứa các thành phần chỉ thị giúp cho sự phát hiện dễ dàng đối lượng vi sinh vật mục tiêu. Tác nhân phân biệt trong môi trường phân biệt:
- + Chỉ thị pH: Lên men đường tạo acid và làm giảm pH, decarboxyl amino acids và thủy phân urea tạo ra ammonia amine khiến tăng pH. Chỉ thị pH thường dùng là phenol red, methyl red và brom cresol purple.
- + Chỉ thị H2S: Một số vsv phân giải amino acid tạo H2S. H2S được phát hiện bằng cách sử dụng muối sắt như sắt citrate, ferric ammonium citrate… tạo ra FeS có màu đen.
- + Phản ứng lòng trắng trứng: Một số vsv tạo lypolytic enzymes khiến môi trường có chứa lòng trắng trứng xung quanh khuẩn lạc trở nên trong hơn.
- + Phản ứng phân huỷ hồng cầu máu: Để phân biệt một số VK độc hại như Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes.
- - Môi trường thử nghiệm sinh hóa: là môi trường dùng để xác định một hoặc vài đặc điểm sinh hoá của chủng vi sinh vật đã phân lập và làm thuần, tạo cơ sở để định danh chủng.
- Chỉ thị màu môi trường
- Trong rất nhiều các phản ứng sinh hoá dùng trong quá trình phân tích vi sinh vật, thành phần môi trường của các thử nghiệm này thường có chứa những chất chỉ thị màu. Các chất chỉ thị màu hoạt động theo nhiều nguyên tắc khác nhau như làm cho tế bào vi sinh vật, khuẩn lạc của chúng có màu, làm cho môi trường có màu hoặc thay đổi màu.... Trong các nguyên tắc đó, thì sự thay đổi màu theo sự thay đổi của pH môi trường là phổ biến nhất ở các phản ứng sinh hoá. Mỗi một chất chỉ thị màu thay đổi màu theo những giá trị pH khác nhau.
Do đó, ở mỗi phản ứng, cần căn cứ vào đặc tính của vi sinh vật khi phân tích, môi trường nuôi cấy, đặc điểm cần nhận diện mà bổ sung những chất chỉ thị màu cho phù hợp.
Bảng. Một số chất chỉ thị màu và ngưỡng pH thay đổi màu của chúng -
- - - - - -
- - - - -
2.3.2. Pha chế, chuẩn bị môi trường
Hiện hay hầu hết các phòng kiểm nghiệm vi sinh vật đều sử dụng môi trường đông khô thương phẩm của các hãng chuyên nghiệp MERCK, OXOID, HIGH- MEDIA… để pha chế môi trường nhằm hạn chế biến động thành phần môi trường ở các lần kiểm nghiệm khác nhau. Việc pha chế môi trường nuôi cấy từ các môi trường đông khô này tương đối đơn giản với các bước cân, hoà tan, chỉnh pH và hấp khử trùng. Phương pháp pha chế môi trường này được thực hiện như sau:
- Cân, đong đúng lượng môi trường đông khô theo chỉ dẫn
- Bổ sung một thể tích nước cất hoặc nước khoáng bằng nửa dung tích cần thiết.
Lắc kỹ, bổ sung phần nước còn lại. Nếu môi trường có agar hoặc gelatin, cần phải gia nhiệt để làm tan môi trường.
- Điều chỉnh pH môi trường. Để điều chỉnh pH dùng NaOH 1N hoặc HCl 1 N - Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa thích hợp, làm nút đậy cho các dụng cụ chứa.
- Tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực - Kiểm tra độ vô trùng của môi trường nuôi cấy Một số điểm cần lưu ý khi pha chế môi trường:
- Bảo quản sai quy định (nhiệt độ, độ ẩm, oxy hóa…) dẫn đến môi trường bị hỏng
- Sử dụng dụng cụ chứa (thủy tinh) bị nhiễm chất tẩy rửa hoặc hóa chất khác - Trộn không đều, hòa tan chưa hoàn toàn
- Đun quá nóng hoặc tiệt trùng quá lâu: thủy phân agar, caramel hóa đường, giảm pH, tăng hoặc giảm các chất ức chế do chất màu trong môi trường chọn lọc bị mất, tạo thành các chất ức chế mới.
- Xác định pH sai, dẫn đến cho quá nhiều kiềm hoặc acid
- Môi trường, hóa chất chứa chất có màu cần bảo quản tránh ánh sáng (giữ ở phòng tối, dụng cụ chứa có màu, bọc bằng giấy nâu hoặc giấy nhôm)