4.ĐỊNH LƯỢNG E.COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
5. ĐỊNH TÍNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
5.1.Nguyên tắc
Salmonella được phát hiện từ 1880, đại đa số là vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và gây bệnh (sốt thương hàn).
Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, trực trùng gram âm, hô hấp tùy tiện, có khả năng di động, không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, khoâng sinh indole, khoâng phaân giải urea, không có khả năng tách
nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Các loại thực phẩm đều yêu cầu phải kiểm nghiệm Salmonella với tiêu chuẩn không phát hiện/25 g(ml)
Như vậy việc xác định thông thường chỉ dừng ở mức độ định tính, tên chủng chỉ được xác định trong những trường hợp quan trọng. Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm, do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng đối chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các môi trường hay mẫu vật sau khi nuôi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa. Do trong thực phẩm Salmonella thường tồn tại ở số lượng ít, tế bào có thể bị tổn thương do đó quy trình xét nghiệm thông thường gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khaỳng ủũnh.
5.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường và hóa chất 5.2.1..Dụng cụ và thiết bị
Bảng 5.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 5
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l) Que trang, que cấy vòng Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Pipette 1 ml, 10 ml Lò viba
Hình 5.1.
Salmonella
5.2.2.Môi trường và hóa chất
Bảng 5.2.Môi trường và hóa chất chỉ tiêu5
Môi trường Hóa chất
Dung dòch Buffered Peptone Water
(BPW) Cồn 90o và 70o
Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Pepton (RV) Dd creatine 0,5 %
Selenit xystin / Tetrathionat (TT) Dung dòch - naphtol 5%
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%
Mơi trường Hektoen Entric Agar (HE) Thuốc thử Kovac Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) HCl 10%
Môi trường Lysine Decacboxylase
broth (LDC) NaOH 10%
Môi trường KIA hoặc TSI
5.3.Thực hành
5.3.1.Quy trình phân tích
Phaân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt XLD, HE, BS, SS…
Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh LBS, mỗi nồng độ 3 ống
lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- KIA/TSI: đỏ/vàng, có /không H2S, sinh hơi/không - Urea (-), Indol (-), VP (-)
- LDC (+),ONPG (-)
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cấy sang canh BHI hoặc thạch TSA, ủ qua đêm, 37 oC
5
Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh:
( ngưng kết với ít nhất một trong hai kháng huyết thanh đa giá OMA,OMB)
Cấy 1 ml canh khuẩn BPW sang RV, ủ 42 oC, 18 -24 g; và sang Selenit cystein/TT ,ủ 370C /24g Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml dung dịch
BPW
Ủ 37 oC, 18 – 24 giờ
Salmonella dương tính/âm tính trên 25g(ml) thực phẩm
5.3.2.Các bước tiến hành Bước 1. Tăng sinh
- Cân 25g mẫu đã nghiền, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml môi trường BPW, lắc đều để ở 370C trong 24 giờ.
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
- Hút 1ml canh khuẩn BPW sang môi trường RV, nuôi trong 24 giờ ở 42oC.
- Hút 1ml canh khuẩn BPW sang môi trường Selenit- cystin/TT, nuôi trong 24 giờ ở 37oC.
Bước 3. Phân lập và nhận diện
- Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh chọn lọc lên đĩa petri chứa môi trường phân lập. Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt. Để ở 370C trong 24 giờ. Trên các môi trường phân lập. Trên môi trường XLD, Salmonella tạo các khuẩn lạc đỏ hồng, có hoặc không có tâm đen. Trên môi trường HE khuẩn lạc Salmonella điển hình có màu xanh lam, có hoặc không có taõm ủen
\
Bước 4. Thử phản ứng sinh hóa Thử nghiệm TSI/KIA):
Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.
Cấy đâm sâu phần cột thạch và cấy ria lên phần thạch nghiêng vi khuẩn từ những khuẩn lạc điển hình/nghi ngờ
54
Hình 5.2. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD (trái), HE (phải)
1. Không có VSV
2. Lên men lactose và glucose (môi trường màu vàng) 3. Sinh khí
4. Chỉ lên men lactose (đỏ trên bề mặt, vàng ở dưới )
lờn ống thạch nghiờng chứa mụi trường KIAứ. Ủ ở 370C trong 24 giờ.
Diễn giải sự biến đổi môi trường như sau:
Cột thạch:
- Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)
- Màu đỏ hoặc không đổi màu: glucose âm tính (không leân men glucose)
- Màu đen: có tạo thành sunfua hidro
- Có bọt khí hoặc có vết nứt : sinh khí từ glucose Bề mặt thạch nghiêng:
- Màu vàng: lactose/saccharose dương tính (có sử dụng lactose/saccharose)
- Màu đỏ hoặc không đổi màu: lactose/saccharose âm tính
Thử nghiệm LDC
Lấy một que cấy đầy khuẩn lạc trên môi trường TSA cấy ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng LDC, Ủ ở 370C trong 24 giờ
Trên môi trường LDC, Salmonella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi trường sang tím hay đỏ tía[LDC (+)], LDC (-) khi môi trường có màu vàng.
Thử nghiệm urea
Thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6,8 - 8,4). Có thể sử dụng môi trường urea thạch cơ bản có bổ sung urea.
Lấy đầy một que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào ống chứa 3ml-5ml môi trường RSU vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37oC trong 48 giờ.
Salmonella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; nếu phản ứng dương tính, việc phân giải ure sẽ giải phóng NH3 làm đổi màu phenol red sang màu hoa hồng và sau đó chuyển sang màu đỏ tím.
Thử nghiệm VP
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02 giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm 02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong vòng 15 phút là phản ứng dương tính
VP (-) VP (+)
Urea (-) Urea (+)
Hình5.4. Thử nghiệm Urea
Hình 5.6.Thử nghiệm indol
Salmonella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường.
Thử nghiệm indol
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường TW, nuôi 37oC ± trong 24 giờ.
Sau nuôi, thêm 1 ml thuốc thử Kovacs. Phản ứng dương tính khi có vòng đỏ trên bề mặt môi trường.
Thử nghiệm β-galactosidase
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có 0,25ml nước muối 0,85%, thả một đĩa giấy ONPG vào ống nghiệm, đặt ống nghiệm vào nồi cách thủy
37 ± 1 oC, để yên vài phút, đọc kết quả. Phản ứng dương tính đổi màu môi trường sang vàng
Thử nghiệm kháng huyết thanh
+ Kiểm tra sự tự dính kết của các chủng;
Cho một giọt dung dịch nước muối sinh lý lên một phiến kính đã rửa sạch. Dàn đều khuẩn lạc cần thử nghiệm trong giọt dung dịch sao cho thu được một thể huyền phù đục đồng nhất. Lắc nhẹ phiến kính trong 30-60 giây.
Quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất nên dùng kính lúp.
Nếu các vi khuẩn vón lại thành các đơn vị ít nhiều có kết dính thì chủng này được coi là tự kết dính và không cần phải thử tiếp vì việc phát hiện kháng nguyên không thể thực hiện được.
+ Kiểm tra kháng nguyên O:
Sử dụng một khuẩn lạc thuần khiết không tự ngưng kết, tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự kết dính ở trên, bằng cách thay một giọt kháng huyết thanh O thay cho dung dịch nước muối.
Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng được coi là dương tính. Sử dụng tuần tự một kháng huyết thanh đa giá và đơn giá.
+ Kiểm tra kháng nguyên Vi:
Tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự kết dính bằng cách thay một giọt huyết thanh Vi thay cho dung dịch nước muối.
Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng coi là dương tính.
+ Kiểm tra kháng nguyên H:
Cấy từ 1 khuẩn lạc không tự dính kết thuần khiết lên thạch dinh dưỡng thể nữa đặc (phần dính kèm), ủ ấm 18-24 giờ, 371oC.
Dùng giống này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành như phương pháp kiểm tra sự tự dính kết, nhưng sử dụng một giọt kháng huyết thanh H thay cho dung dịch nước muối sinh lý.
Nếu xuất hiện dính kết, phản ứng coi là dương tính.
LƯU Ý
Có thể sử dụng kháng huyết thanh đa giá OMA, OMB để phát hiện sự có mặt của các kháng nguyên Salmonella. Trên 98% các chủng Salmonella cho phản ứng ngưng kết với một trong hai kháng huyết thanh OMA, OMB. Do vậy khi thấy có sự dính kết với một trong hai kháng huyết thanh đa giá trên có thể kết luận là Salmonella.
5.3.4.Kết quả
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Salmonella được phát hiện trong 25g mẫu
5.4.Câu hỏi ôn tập
1. Nêu các bước trong quy trình phân tích Salmonella 2. Vai trò của môi trường tăng sinh BPW ?
4. Môi trường tăng sinh chọn lọc dùng trong quy trình phân tích Salmonella là gì?
5. Vai trò của môi trường tăng sinh chọn lọc?
6. Giải thích tại sao khuẩn lạc Salmonella có thể có tâm đen?
7. Trình bày các phản ứng sinh hóa dùng trong phân tích Salmonella: tên môi trường, hóa chất, kết quả, giải thích kết quả.