PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC)
10. ĐỊNH TÍNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM
10.1.Nguyên tắc
Shigella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kị khí tùy tiện, cho thử nghiệm catalase (+) (trừ Shigella dysenteriae), oxidase (-), lên men glucose không sinh hơi, hầu hết các loài không lên men và tạo acid từ latose, dulcitol, không sinh H2S, không có enzyme lysine decarboxylase.
Shigella có thể được phát hiện bằng cách cấy một lượng mẫu xác định vào môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc.
Dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 loại môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
10.2.Dụng cụ, thiêt bị, môi trường và hóa chất 10.2.1.Dụng cụ và thiết bị
Bảng 10.1. Dụng cụ và thiết bị chỉ tiêu 10
Dụng cụ Thiết bị
Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng
Đĩa petri (100 mm) Nồi hấp
Cốc thuỷ tinh (100 ml, 250 ml) Tủ ấm
Đầu tip Pipetman (1000, 5000 l) Pipetman (1000, 5000 l) Que trang, que cấy vòng Máy dập mẫu (Stomacher)
Kẹp inox Máy trộn mẫu (vortex mixer)
Đèn cồn Cân phân tích
Pipette 1 ml, 10 ml Lò viba
10.2.2.Môi trường và hóa chất
Bảng 10.2.Môi trường và hóa chất chỉ tiêu 10
Môi trường Hóa chất Dung dòch Trypton Soya (TSB) Cồn 90o và 70o
Canh Gram Negative (GN) Dd creatine 0,5 %
Tergitol-7 Agar (T7A) Dung dòch - naphtol 5%
Thạch Xylose Lysine Desoxycholate (XLD) KOH 40%
Môi trường Hektoen Entric Agar (HE)
Deoxycholate Citrat Agar (DCA) HCl 10%
Thạch Mac Conkey (MAC) NaOH 10%
Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) Thuốc thử catalase Môi trường Lysine Decacboxylase
broth (LDC) Que thử oxydase
Môi trường KIA hoặc TSI RSU
10.3.Thực hành
10.3.1.Quy trình phân tích
Chọn ít nhất 05 khuẩn lạc nghi ngờ cấy lên TSA , ủ 370C trong20-24giờ
Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml môi trường GN, ủ 370C , 16 – 24 giờ
Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml TSB, ủ 370C , 16 – 24 giờ
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc phân biệt (T7A,MAC,XLD,HE,DC…), ủ 370C , 24 – 48giờ
Thử nghiệm sinh hóa:
KIA/TSI : đỏ/vàng, H2S (-), gas (-)
10.3.2.Các bước tiến hành Bước 1. Tăng sinh
- Cân 25g mẫu đã nghiền, hoặc hút 25 ml mẫu cho vào bình đã chứa sẵn 225ml môi trường TSB, lắc đều , ủ 370C , 16 – 24 giờ
Bước 2. Tăng sinh chọn lọc
- Chuyển 0,1 ml dịch tăng sinh sang 10 ml canh tăng sinh GN, ủû 37oC trong 10-20 giờ.
Bước 3. Phân lập
- Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh chọn lọc lên đĩa petri chứa môi trường phân lập. Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt. Để ở 370C trong 24-48 giờ. Nên sử dụng ít nhất 2 môi trường phân lập khác nhau. Treân môi trường XLD, Shigella tạo các khuẩn lạc đỏ,trong suốt. Trên môi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh nhạt, trong suốt. Trên môi trường T7A khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh nhạt (mơi trường đục như sữa, cĩ màu xanh hơi vàng nhạt). Trên môi trường MAC khuẩn lạc Shigella điển hình có màu đỏ nhạt (môi trường có màu đỏ cam, hơi đục)
Bước 4. Thử phản ứng sinh hóa Thử nghiệm sàng lọc trên TSI/KIA ):
Môi trường KIA được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose) và khả năng sinh H2S.
Cấy đâm sâu phần cột thạch và cấy ria lên phần thạch nghiêng vi khuẩn từ những khuẩn lạc điển hình/nghi ngờ 77
1. Không có VSV
2. Lên men lactose và glucose (môi trường màu vàng) 3. Sinh khí
4. Chỉ lên men lactose (đỏ trên bề mặt, vàng ở dưới )
Thử nghiệm sinh hóa khẳng định
Kết luận: Shigella dương tính/âm tính trong 25 g mẫu
lờn ống thạch nghiờng chứa mụi trường KIAứ. Ủ ở 370C trong 24 giờ.
Diễn giải sự biến đổi môi trường như sau:
Cột thạch:
- Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)
- Màu đỏ hoặc không đổi màu: glucose âm tính (không leân men glucose)
- Màu đen: có tạo thành sunfua hidro
- Có bọt khí hoặc có vết nứt : sinh khí từ glucose Bề mặt thạch nghiêng:
- Màu vàng: lactose/saccharose dương tính (có sử dụng lactose/saccharose)
- Màu đỏ hoặc không đổi màu: lactose/saccharose âm tính
Thử nghiệm khẳng định :
Các đặc trưng sinh hóa của Shigella được tóm tắt theo bảng :
Thử nghiệm sinh hóa Kết quả Thử nghiệm sinh hóa Kết quả
Simmon citrate - Saciline -
Arginine decarboxylase - Xylose -
Lysine decarboxylase - Cellobiose -
Urea - Adonitol -
Malonate - Dulcitol -
MR + Inositol -
VP -
Thử nghiệm LDC
Lấy một que cấy đầy khuẩn lạc trên môi trường TSA cấy ngay dưới bề mặt của môi trường lỏng LDC, Ủ ở 370C trong 24 giờ
Trên môi trường LDC, Shigella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi trường sang tím hay đỏ tía[LDC (+)], LDC (-) khi môi trường có màu vàng.
Thử nghiệm urea
Thực hiện trên môi trường urea lỏng RSU chứa chỉ thị đỏ phenol, chuyển màu từ vàng sang đỏ (vùng chuyển màu là pH 6,8 - 8,4). Có thể sử dụng môi trường urea thạch cơ bản có bổ sung urea.
Lấy đầy một que cấy vòng từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào ống chứa 3ml-5ml môi trường RSU vô trùng, lắc nhẹ ống để trộn đều vi khuẩn và ủ ở 37oC trong 48 giờ.
Shigella không phân giải urea nên không làm thay đổi pH môi trường; nếu phản ứng dương tính, việc phân giải ure sẽ giải
phóng NH3 làm đổi màu phenol red sang màu hoa hồng và sau đó chuyển sang màu đỏ tím.
Thử nghiệm VP
Hòa một vòng que cấy đầy từ khuẩn lạc trên môi trường TSA vào các ống môi trường MR-VP ủ ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, lấy 0,2 ml dịch cấy vào 01 ống nghiệm, thêm 02 giọt creatin, 06 giọt dung dịch 1- naphthol trong cồn, sau đó thêm 02 giọt KOH 40%, việc xuất hiện màu hồng đến màu đỏ tươi trong vòng 15 phút là phản ứng dương tính
Shigella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, không đổi màu trên bề mặt môi trường. Thử nghiệm VP (+) khi có màu đỏ trên bề mặt môi trường
10.3.4.Kết quả
Với quy trình kiểm nghiệm này cho phép kết luận có hay không có Shigella được phát hiện trong 25g mẫu
10.4.Câu hỏi ôn tập
1. Nêu các bước trong quy trình phân tích Shigella
2. Nêu hình thái các khuẩn lạc đặc trưng Shigella trên các môi trương phân lập khác nhau
VP (-) VP (+)
Urea (-) Urea (+)
Hình5.4. Thử nghiệm Urea