KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
3. Đếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang
Khi nhuộm vi sinh vật bằng một số thuốc nhuộm phát huỳnh quang như:
- Acridin Cam (AODC)
- 4, 6 – dianidino – 2 – phenyl – indol (DAPT) - Fluoresecin isothio cyanate (FITC)
Mật độ vi sinh vật có thể xác định trực tiếp dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Số đếm nhận được bằng phương pháp này có thể cao gấp 2 lần phương pháp đếm khuẩn lạc. Sự sai khác này do các tế bào chết hoặc tổn thương không có khả năng phát triển thành khuẩn lạc.
Kết quả số đếm vi sinh vật bằng kính huỳnh quang phản ánh số vi sinh vật có thật trong mẫu.
2.7. THỬ NGHIỆM SINH HÓA
Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật, sau khi phân lập, việc định danh vi sinh vật là một vấn đề rất quan trọng. Việc định danh này được thực hiện dựa và các đặc điểm về kiểu hình, đặc biệt là các phản ứng sinh hoá thực hiện bởi các chủng vi sinh vật.
Thông thường để thực hiện các phản ứng sinh hoá có thể tiến hành theo một trong ba cách là cách truyền thống, sử dụng bộ KIT và dùng thiết bị tự động.
Trong kiểm nghiệm, phân tích, các kết quả thử nghiệm sinh hoá biểu thị quy ước bằng các ký hiệu như: (+): dương tính; (-): âm tính; (+/-): khoảng trên 70% là dương tính và (-/+): khoảng trên 70% là âm tính.
Trong các thử nghiệm sinh hoá, để đảm bảo chính xác trong việc đọc kết quả, người ta thường thực hiện thử nghiệm trên các chủng đối chứng. Một số chủng đối chứng cho các thử nghiệm sinh hoá thường dùng được trình bày trong bảng sau:
Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC
Acinetobacter calcoaceticus Aci. lwoffi
7844 5886
15308 15306
Aeromonas hydrophila 8049 7966
Alkaligenes faecalis 415 19018
Bacillus cereus Bac. subtilis
10876 6633
7464 10400 Clostridium histolyticum
Clos. Perfringens
19401 13124
503 8237
Edwardsiella tarda 10396 19547
Enterobacter aerogenes Ent. cloacae
13048 10005
10006 -
Enterococcus faecalis 29212 -
Escherichia coli 25922 10418
Mycobacterium fortuitum Myco. kansasii
Myco. phlei
10349 10268 8151
6841 14471 19249
Tên chủng Mã số NCTC Mã số ATCC
Myco. terrae 10856 15755
Norcadia brazilensis Nor. otitidicarcaviarum
11274 1934
19296 14629 Proteus mirabilis
Pro. rettgeri
10975 7475
- -
Pseudomonas aeruginosa 10662
Serratia marcescens 13880 10218
Staphylococcus aureus Staph. epidermidis
25923 12228
6571 - Streptococcus agalactiae
Strep. pneumoniae Strep. salivarius
13813 6303 8681
8181 - 7073
Các thử nghiệm sinh hoá quan trọng thường sử dụng trong phân tích vi sinh vật bao gồm như sau:
1. Thử nghiệm khả năng lên men
Thử nghiệm khả năng lên men là thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vi sinh vật để tăng trưởng theo con đường lên men. Tùy theo vi sinh vật và nguồn cơ chất muốn kiểm tra có thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy những nguồn cơ chất khác nhau. Sản phẩm tạo thành từ quá trình sống này sẽ làm giảm pH của môi trường nuôi cấy và từ đó làm thay đổi màu của chất chỉ thị màu được bổ sung vào môi trường.
Chất chỉ thị màu thường sử dụng trong thử nghiệm là phenol red.
2. Thử nghiệm khả năng oxy hoá-lên men
Thử nghiệmkhả năng oxy hoá – lên men nhằm mục đích xác định vi sinh vật biến dưỡng nguồn carbon hydrat theo con đường lên men hay hô hấp. Phản ứng được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành từ quá trình sống của vi sinh vật và có thể làm chuyển màu của chất chỉ thị màu bổ sung vào môi trường theo những cách khác nhau.
Thử nghiệm tiến hành trên môi trường Hugh-Leifson chứa chỉ thị pH là bromothymol blue
3. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng citrat làm nguồn carbonhydrat duy nhất của vi sinh vật. Ở những chủng có đặc tính này , sẽ có khả năng dùng muối amoniu. Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường Simmon citrate có nguồn carbon duy nhất là citrae với sự hiện diện của chất chỉ thị màu bromothymol blue.
4. Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng sử dụng malonat làm nguồn carbon duy nhất. Ở những chủng có đặc tính này, sẽ có khả năng dùng muối amonium. Thử nghiệm được tiến hành trên môi trường malonate broth với chất chỉ thị màu bromothymol blue.
5. Thử nghiệm catalase
Thử nghiệm dùng để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và với sinh vật kỵ khí. Vi sinh vật hiếu khí có enzym catalase, có khả năng phân giải H2O2 (chất rất độc đối với tế bào) thành H2O và O2. Phản ứng được nhận diện nhờ sự sủi bọt của giọt H2O2 khi O2
bay lên.
6. Thử nghiệm decarboxylase
Thử nghiệm dùng để phân loại và định danh các loại vi khuẩn đường ruột, dựa trên loại enzym decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải một acid amin đặc trưng, tạo CO2 làm tăng pH môi trường.
7. Thử nghiệm coagulase
Thử nghiệm thường dùng để định danh Staphylococcus. Loài này có khả năng tiết enzym coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần huyết tương, tạo khối đông huyết tương.
8. Thử nghiệm urease
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng tạo enzym urease của một số chủng vi sinh vật, nhất là nhóm Proteus. Enzym này xúc tác phản ứng phân giải urê thành NH3
và CO2 làm tăng pH của môi trường.
9. Thử nghiệm gelatinase
Thử nghiệm dùng để đánh giá khả năng tiết enzym gelatinase phân giải gelatine thành polypeptid và acid amin của các đối tượng vi sinh vật.
10. Thử nghiệm khả năng sinh H2S
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng phân giải các acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) sinh H2S nhờ enzym desulfuahydrase.
11. Thử nghiệm khả năng sinh idol
Thử nghiệm dùng để xác định khả năng chuyển hoá các sản phẩm trung gian của quá trình oxy hoá thành indol. Sản phẩm indol tạo thành được xác định nhờ phản ứng với thuốc thử p-dimethylaminobenzaldehide tạo phức hợp dạng qiunon có màu đỏ.
12. Thử nghiệm KIA, TSI
Thử nghiệm KIA hay TSI là thử nghiệm được thực hiện đồng thời trên môi trường KIA, TSI dùng để kiểm tra khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose, lactose, sucrose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật.
13. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate)
Thử nghiệm dùng để kiểm tra đặc tính sử dụng enzym nitratase để khử nitrat thành nitrite và các sản phẩm khác. Nitrite tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng
với sulphanilamide và N-napthylethylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu hồng.
14. Thử nghiệm oxidase
Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzym oxydase ở vi sinh vật.
Hoạt tính oxydase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện của enzym, thuốc thử bị oxy hoá một hợp chất indolphenol có màu xanh dương.
15. Thử nghiệm ONPG
Thử nghiệm dùng để xác định hoạt tính enzym -galactosidase tham gia vào quá trình lên men lactose ở vi sinh vật. Môi trường thử nghiệm là ONPG broth chứa o- nitrophenyl-D-galactopyranoside. Sản phẩm tạo thành là o-nitrophenol có màu vàng.
16. Thử nghiệm MR (Methyl Red)
Thử nghiệm nhằm phân biệt vi sinh vật dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sản phẩm có tính acid từ sự lên men glucose. Vi sinh vật lên men glucose tạo và duy trì sản phẩm acid, làm đổi màu thuốc thử methy red trong môi trường. Nếu sản phẩm acid tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính, không làm đổi màu thuốc thử.
17. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)
Phản ứng dùng phân biệt các loài trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxi hoá acetoin được tạo ra từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Diacetyl được xác định dựa vào phản ứng kết hợp với nhân guanidine của pepton tạo phức đỏ.
18. Thử nghiệm CAMP
Phản ứng nhằm phân biệt các nhóm Streptococcus. Phản ứng CAMP là thực hiện giữa nhân tố CAMP do Streptococcus nhóm B tiết ra và -hemolysin được tiết ra bởi Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của -hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết)
19. Thử nghiệm tính di động
Là thử nghiệm dùng để xác định đặc tính di động nhờ tiêm mao của vi sinh vật.
Thử nghiệm được thực hiện trên môi trường bán lỏng. Kết quả được xác định dựa vào kích thước của vệt cấy vi sinh vật.
Bộ KIT sinh hoá định danh vi sinh vật
Ngày nay, các thử nghiệm sinh hoá truyền thống để định danh vi sinh vật đã có thể thực hiện ở các thuốc thử ở dạng đĩa giấy, que giấy. Ngoài ra, còn có các bộ KIT cho phép thực hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hoá theo một quy trình hai lựa chọn để định danh vi sinh vật. Các bộ KIT này được sản xuất dưới dạng thương phẩm có ưu điểm là tiết kiệm thời gian, công sức; tuy nhiên cũng có nhược điểm ví dụ như mỗi bộ KIT chỉ cho phép định danh một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn
Hình 24. Các dạng KIT sinh hoá định danh vi sinh vật