2.1. Cơ sở khoa học của đề tài
2.1.4. Những phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng
2.1.4.2. Chẩn đoán thí nghiệm
Có nhiều phương pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thí nghiệm, mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc. Tùy từng trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp hoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao.
* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:
Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phương pháp sau:
- Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T. evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi;
vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi. Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến
kính đã có sẵn 1 giọt Natri citrat 3,8%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men lên để máu dàn theo la men thành một lớp mỏng. Soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10 và 10 x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống.
- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)
+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng một góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính khoảng 1 - 1,25 cm. Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn Methanol, nhuộm Giemsa (Pha giemsa mẹ với nước cất theo tỷ lệ 1:9) trong 25 phút. Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô rồi soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100).
Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng, do đó khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều loài tiên mao trùng cùng một lúc.
+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2 phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (Pha giemsa mẹ với nước cất theo tỷ lệ 1:9). Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100).
Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái các loài tiên mao trùng khác nhau.
+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) là chất làm tan hồng cầu. Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng được phát hiện trong máu. Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da và tránh hút bằng pipet. Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trong nhiều tháng.
* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:
Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằng ống Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose.
- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (Woo, 1971 [41]): cho máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt kín bằng chất dẻo matit, một đầu ống để hở. Ly âm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị
trí tiếp giáp giữa huyết tương và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).
Phương pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phương pháp xem tươi và nhuộm Giemsa. Song, tỷ lệ phát hiện chưa cao.
Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground:
dùng cưa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết tương và hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tương lên phiến kính, đậy la men và kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 40).
* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:
Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Phương pháp này có ưu điểm là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khi nhân chúng lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm. Song, nhược điểm của phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được (Lê Ngọc Mỹ, 1994 [14]; Đoàn Văn Phúc và cs, 1994 [17]).
* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:
Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng. Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu.
- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng
Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng. Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ:
+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination Test): hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao trùng vào, trộn đều, đậy la men và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20 hoặc 10 x 40). Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là (+) và ngược lại là (-).
Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng.
+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động có trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T.
evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể. Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt (epitop surface). Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của kháng nguyên. Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại. Kết quả là các hạt latex cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể quan sát bằng mắt thường. Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng nguyên bề mặt được tinh chế từ chủng T. evansi không nhuộm màu.
Phương pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứng dụng ở cơ sở. Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện bệnh không cao do phương pháp này cho kết quả dương tính cả khi con vật khỏi bệnh nhưng vẫn còn kháng thể tồn tại trong huyết thanh; mặt khác, đối với những súc vật mới nhiễm bệnh TMT trong huyết thanh chưa có kháng thể nên khi kiểm tra bằng phương pháp LATEX sẽ cho kết quả âm tính.
+ Phương pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu động vật nhiễm bệnh.
Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã được nhuộm màu kết hợp với kháng thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh.
Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng nguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều. Cho vào lọ kháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml dung dịch buffer, lắc đều. Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ cần chẩn đoán (1/8). Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng vào hai vũng trũn khỏc của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45àl). Sau đú
cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn. Dùng que nhựa trộn đều. Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút) và đánh giá kết quả
+ Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Phản ứng này là phản ứng huyết thanh học đặc hiệu có độ nhạy cao, được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và thực địa. Ngoài việc được dùng làm phản ứng chuẩn để so sánh với các phương pháp huyết thanh khác, phương pháp IFAT còn được dùng trong nghiên cứu các dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể (Luckins, 1988 [32]; Davison, 1999 [27]).
Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu bò mắc bệnh tiên mao trùng, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu bò khoẻ mạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh.
Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu và cs (1994) [31] đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng cho phản ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng ớ 1/40. Theo Lương Tố Thu và Lê Ngọc Mỹ (1996) [22], độ nhậy của phương pháp IFAT là 71,25%.
Để tinh chế kháng nguyên T. evansi dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, Vương Thị Lan Phương (2004) [18] đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T. evansi phân lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6 mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT (Variable Antigenic Type) và thu được 26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác nhau. Bằng phản ứng dung giải miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch, tác giả đã xác định được sự thay đổi kháng nguyên bề mặt của T. evansi: đa số các VAT của các kho kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8 VAT/26 VAI có hiệu giá kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với các VAT của các kho kháng nguyên khác. Các VAT trội xuất hiện sớm trong 4 tuần lễ đầu nhiễm bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán. Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên theo phương pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán
bệnh tiên mao trùng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)
Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhất được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng.
Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng Globulin (kháng kháng thể) có mang một enzym (phosphatase hoặc Peroxydase) được gắn trên mảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó, cho cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym và bị enzym phân huỷ tạo nên màu. So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng.
Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thế giới. Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [15] đã bước đầu chế kháng nguyên tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta.
* Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng - Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA)
Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh. Phản ứng dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiên mao trùng. Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [15] đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. Tuy nhiên, theo cơ quan năng lượng nguyên tử thế giới (IAEA) (1997), phương pháp ELISA kháng nguyên có độ nhậy kém hơn so với các phương pháp phát hiện tiên mao trùng cổ điển. Vì vậy, phương pháp này đã không được phổ biến trong thời gian hiện tại và tương lai (IAEA đã không sản xuất đĩa Ag - ELISA cho nhiều nước trên thế giới).
- Phản ứng Suratex:
Phản ứng Suratex là phản ứng ngưng kết giữa các hạt latex được gắn kháng thể đơn dòng với kháng nguyên lưu động trong máu động vật nhiễm tiên mao trùng (Tamarit. 2010 [35]). Phản ứng này hiện đang được thử nghiệm và đánh giá ở thực địa.
- Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (plymerase Chain Reaction):
PRC là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để
chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đây.
Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định sự có mặt của gen ADN của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh
Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi có trình độ kỹ thuật cao, trang thiết bị hiện đại nên hiện nay mới được tiến hành tại một số phòng thí nghiệm hiện đại.