Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp lấy mẫu máu
Sát trùng cổ trâu, bò bằng cồn 700. Dùng kim trích máu vô trùng chọc ngang một tĩnh mạch cổ, cho máu chảy vào ống Tube không có tráng chất chống đông, ghi ký hiệu mẫu; tên chủ hộ; địa chỉ; ngày lấy mẫu.
Phương pháp lấy mẫu huyết thanh
Lấy mẫu máu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đa. Cố định ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 370C, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì bỏ ống nghiệm vào tủ lạnh ở nhiệt độ 4 - 60C trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh. Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh ly tâm 1000 vòng/ phút để loại bỏ hồng cầu. Bảo quản huyết thanh ở 200C.
3.4.2. Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trong mẫu 3.4.2.1. Phương pháp xem tươi (Direct smear)
T. evansi là loại ký sinh trùng sống trong máu và trong tổ chức, trong trường hợp mật độ ký sinh trùng trong máu thấp, tiên mao trùng sống ở trong các vi mạch nhỏ. Vì vậy có thể lấy máu ngoại vi để tìm T. evansi.
Cho 1 giọt máu tươi lên phiến kính đã có sẵn 1 giọt dung dịch EDTA 1%;
Đặt 1 lamen lên giọt máu để dàn máu thành một lớp mỏng, sau đó soi dưới kính hiển vi (10x20 hoặc 10x40) để phát hiện T. evansi đang di động trên tiêu bản.
Kết quả:
Dương tính: Thấy tiên mao trùng di động trong huyết tương.
Âm tính: Chỉ nhìn thấy hồng cầu.
3.4.2.2. Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Ramanovsky)
Đặt một giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng lamen dàn máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2 phút.
Nhuộm Giemsa trong 25 phút (Pha dung dịch giemsa mẹ với nước cất theo tỷ
lệ 1:9). Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10x100), quan sát tìm T. evansi.
Kết quả: Dương tính khi tìm thấy tiên mao trùng bắt màu xanh tím, nhân bắt màu tím đậm hoặc xanh thẫm. Tiên mao trùng có một nhân chính và một nhân phụ, roi... Hồng cầu bắt màu hồng đều.
3.4.2.3. Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm.
Dùng máu tươi của trâu, bò tiêm trực tiếp cho chuột bạch (không sử dụng chất chống đông). Mỗi chuột tiêm 0,2 ml máu vào phúc mạc. Theo dõi biểu hiện của chuột thí nghiệm sau tiêm truyền. Mỗi ngày kiểm tra máu chuột thí nghiệm 1 lần để phát hiện tiên mao trùng bằng phương pháp soi tiêu bản máu tươi.
3.4.3. Phương pháp đếm tiên mao trùng trong máu động vật gây nhiễm và xác định liều gây nhiễm
3.4.3.1. Phương pháp xác định số tiên mao trùng/ml máu chuột bạch
Tiêm truyền máu trâu có tiên mao trùng vào phúc mạc chuột bạch. Khi máu chuột bạch có khoảng >100 tiên mao trùng/vi trường thì tiến hành đếm số lượng tiên mao trùng trên buồng đếm Neubauer. Các bước cụ thể như sau:
+ Dùng ống pha loãng bạch cầu hút máu đuôi chuột đến vạch 0,5 rồi hút nước muối sinh lý 0,9% đến vạch 11 (như vậy, máu được pha loãng 20 lần)
+ Bịt kín 2 đầu ống hút bằng ngón cái và ngón giữa rồi lắc ống trộn theo hình số 8 ít nhất trong 1 phút để tiên mao trùng được trộn đều trong dung dịch.
+ Buồng đếm được làm sạch và khô. Đậy lamen lên 2 khu vực có kẻ ô đếm. Đặt buồng đếm lên mặt phẳng, lắc lại ống trộn bạch cầu và bỏ đi vài giọt đầu, sau đó nhỏ dung dịch vào khe buồng đếm (chỗ lamen đậy lên), máu pha loãng theo mao dẫn lan khắp các ô đếm.
+ Hơ nhanh buồng đếm trên ngọn lửa đèn cồn trong vài giây cho tiên mao trùng yếu đi (hạn chế sự di chuyển của tiên mao trùng)
+ Đưa buồng đếm lên kính hiển vi và đếm toàn bộ số tiên mao trùng trong 4 ô nhỏ ở 4 góc và 1 ô chính giữa trong khu vực đếm hồng cầu (độ phóng đại 400 lần)
* Số tiên mao trùng trong 1 ml máu được tính bằng công thức Số TMT/ml máu = 5.a.n.100
(a là tổng số TMT được đếm trong 5 ô của buồng đếm, n là hệ số pha loãng)
3.4.3.2. Phương pháp xác định liều gây nhiễm
Sau khi xác định được số tiên mao trùng có trong 1 ml máu chuột bạch, sử dụng máu chuột bạch đó để gây nhiễm cho động vật thí nghiệm. Qua thử nghiệm các liều gây nhiễm, đã xác định được liều bắt đầu có tác dụng gây bệnh, chúng tôi sử dụng liều: 3x107 T. evansi/trâu để gây nhiễm cho 3 trâu thí nghiệm
3.4.4. Gây nhiễm T. evansi cho trâu thí nghiệm
Trâu thí nghiệm gồm 6 con khỏe mạnh, theo dõi trước khi gây nhiễm 2 tuần, xét nghiệm máu và xét nghiệm phân để chắc chắn những trâu này khỏe mạnh, không bị nhiễm kí sinh trùng và các bệnh khác. Tiêm truyền T. evansi vào phúc mạc của 3 trâu với liều 107 T. evansi/trâu, 3 trâu còn lại dùng làm đối chứng.
Hàng ngày lấy máu trâu gây nhiễm và đối chứng xét nghiệm để xác định thời gian T. evansi xuất hiện trong máu; đồng thời theo dõi biểu hiện lâm sàng và xác định thời gian trâu bắt đầu có biểu hiện lâm sàng, đo thân nhiệt, lấy máu xác định một số chỉ số sinh lý máu, xác định bệnh tích đại thể và vi thể.
3.4.5. Phương pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi ở trâu
3.4.5.1.Phương pháp xác định thời gian T. evansi bắt đầu xuất hiện trong máu trâu gây nhiễm
Sau khi gây nhiễm T. evansi cho trâu, 3 ngày 1 lần lấy máu của trâu gây nhiễm và đối chứng tiêm truyền chuột bạch. Khi thấy máu chuột bạch xuất hiện T. evansi thì xác định đó là thời gian T. evansi xuất hiện sớm nhất ở trâu sau gây nhiễm. Tiếp tục theo dõi cho đến khi thấy T. evansi xuất hiện trong máu trâu cuối cùng đó là thời gian T. evansi xuất hiện muộn nhất trong máu trâu sau gây nhiễm.
3.4.5.2. Phương pháp theo dõi thân nhiệt và triệu chứng lâm sàng
- Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng: hàng ngày quan sát những biểu hiện của trâu gây nhiễm: thể trạng, mắt, niêm mạc, phân, ăn uống, vận động.
- Theo dõi thân nhiệt của trâu: hàng ngày dùng nhiệt kế 430C đo thân nhiệt của trâu vào buổi sáng, ở một giờ nhất định; ghi lại thân nhiệt của từng trâu; vẽ đồ thị diễn biến thân nhiệt của mỗi trâu gây nhiễm và đối chứng.
3.4.5.3. Phương pháp mổ khám bệnh tích
Mổ khám trâu sau gây nhiễm 2 tháng, quan sát bằng mắt thường và kính lúp các khí quan trong cơ thể, chụp ảnh những vùng có bệnh tích điển hình. Mổ khám 1 trâu đối chứng để quan sát, so sánh.
3.4.5.4. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
+ Lấy một phần các khí quan có bệnh tích đại thể rõ rệt, cố định trong dung dịch Formol 10%.
+ Làm tiêu bản vi thể theo quy trình cắt cúp tổ chức, tẩm đúc Parafin, nhuộm Hematoxilin - Eosin và quan sát để đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại từ 200 - 400 lần).
3.4.6. Phương pháp so sánh khả năng phát hiện tiên mao trùng của KIT chẩn đoán với phương pháp tiêm truyền chuột bạch.
* Các bước tiến hành:
- Bước 1: Lấy mẫu máu của trâu, bò đã nhiễm tiên mao trùng.
- Bước 2: Sử dụng cả 2 phương pháp chẩn đoán ( Dùng KIT chẩn đoán và phương pháp tiêm truyền chuột bạch ) trên cùng một mẫu máu trâu, bò.
* Kết quả: Khả năng phát hiện tiên mao trùng của KIT cao nếu tỷ lệ phát hiện tiên mao trùng ngang bằng với tỷ lệ phát hiện tiên mao trùng của phương pháp tiêm truyền chuột bạch và ngược lại.
3.4.7. Các bước thực hiện phản ứng CATT
- Bước 1: 10 àl khỏng nguyờn gắn hạt latex đặt lờn khay phản ứng.
- Bước 2: 10 àl khỏng thể nhỏ lờn giọt khỏng nguyờn.