2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ học
Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học như: hồi cứu, mô tả (Descriptive study), dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Như Thanh, 2001)[25].
- Lấy mẫu ngẫu nghiên theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc, mỗi huyện 3 xã, mỗi xã chọn 3 thôn. Ở mỗi thôn lấy mẫu ngẫu nhiên.
- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết, kết hợp với số liệu thống kê dịch bệnh hàng năm của các Trạm thú y, Chi Cục Thú y tỉnh.
2.4.2. Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể trên gà, vịt sau tiêm vắc xin H5N1 Dựa theo hướng dẫn và quy chế giám sát vật nuôi sau tiêm phòng để tiến hành giám sát đàn gia cầm sau khi tiêm vắc xin ngoài thực địa.
2.4.2.1. Giám sát lâm sàng
- Khảo sát độ an toàn của vắc xin đối với đàn gia cầm sau mỗi lần tiêm phòng, tiến hành theo dõi trực tiếp hai đàn gà và một đàn vịt thuộc 05 huyện trên địa bàn tỉnh.
2.4.2.2. Giám sát huyết thanh
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn gà nuôi tại một số huyện đã được tiêm vắc xin H5N1 tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày và 150 ngày.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của các đàn vịt trong tỉnh đã được tiêm vắc xin H5N1 tại các thời điểm sau khi tiêm: 30 ngày, 60 ngày, 90 ngày, 120 ngày.
2.4.2.3. Thu thập mẫu huyết thanh
Đối tượng lấy mẫu huyết thanh là gà, vịt đã tiêm vắc xin H5N1 NAVET- VIFLUVAC đang được nuôi tại tỉnh Quảng Ninh.
Nhổ hết lông tại vị trí lấy máu (mặt dưới cánh). Sát trùng bằng cồn 700 cho nổi rõ tĩnh mạch cánh. Dùng bơm tiêm loại 5ml, chọc kim vào tĩnh mạch theo chiều hướng đầu kim vào phía trong cơ thể gia cầm, lấy từ 2 - 3 ml máu/con, sau đó kéo dài pittong đến 5 ml, bẻ gập đầu kim, đậy nắp kim lại, để nghiêng cho máu đông tự nhiên, chắt lấy huyết thanh.
Mẫu huyết thanh để ở nhiệt độ 40C (bảo quản trong hộp xốp đựng đá) trong vòng 48 giờ, nếu bảo quản lâu hơn, giữ ở nhiệt độ - 200C.
Mẫu huyết thanh được vận chuyển tới phòng xét nghiệm của Cơ quan Thú y vùng II Hải phòng trong điều kiện lạnh (hộp bảo ôn), có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo.
* Gà, vịt chỉ báo: Gà, vịt trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh không được tiêm vắc xin cúm H5N1 dùng làm đối chứng. Lấy mẫu huyết thanh của gà, vịt chỉ báo qua các thời điểm 30, 60, 90, 120, 150 ngày sau tiêm để kiểm tra hiệu giá kháng thể. Từ đó rút ra kết luận đàn gà, vịt trong tỉnh có hiệu giá kháng thể là do miễn dịch tự nhiên hay miễn dịch do vắc xin.
* Chuẩn bị các dung dịch - Pha chế dung dịch PBS:
NaCl 8 gam
KCl 0,2 gam
Na2HPO4 1,15 gam
KH2PO4 0,2 gam
Nước cất vừa đủ 1000 ml
Hấp vô trùng 121oC/ 15 phút, bổ sung kháng sinh có trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1.
- Dung dịch PBS 0,01M, pH 7,2
Na2HPO4 1,096 gam
NaH2PO4.H2O 0,316 gam
NaCl 8,5 gam
Nước cất vừa đủ 1000 ml
Chỉnh pH = 7,2 bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch nước muối sinh lý 0,9%:
Pha 9,0 gam NaCl trong 1000 ml nước cất. Hấp vô trùng, bảo quản 4oC không quá 3 tuần.
- Dung dịch hồng cầu gà 1%:
+ Máu gà trống khoẻ mạnh đã trưởng thành, không có kháng thể kháng virus cúm và Newcastle.
+ Dùng bơm tiêm 5 - 10 ml hút sẵn 1 ml dung dịch chống đông (Natri Citrat 3,8 %) rồi lấy máu gà vào ống nghiệm.
+ Ly tâm 1000 - 1500 vòng/phút, trong 15 phút, gạn bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCl 0,9%) vào hồng cầu, lắc đều. Ly tâm như trên 3 - 4 lần để rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối gạn bỏ nước ở trên.
+ Pha hồng cầu với nước muối sinh lý thành huyễn dịch 1%: pha 1 ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh lý.
+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt độ 4 - 8oC. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng trong 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng).
* Kháng huyết thanh chuẩn:
- Kháng huyết thanh chuẩn được chế tạo từ các loài động vật như thỏ, dê, cừu...
được xử lý bằng RDE (Receptor Destroying Enzyme) trước khi xét nghiệm.
- Kháng huyết thanh chuẩn được chế tạo trên gà thì không cần xử lý bằng RDE. Tuy nhiên, nếu phản ứng cho kết quả không rõ ràng thì kháng huyết thanh có thể xử lý RDE để khẳng định kết quả là dương tính.
- Hoàn nguyên kháng huyết thanh và bảo quản ở nhiệt độ - 20oC, xử lý yếu tố ức chế đặc hiệu kháng huyết thanh vô hoạt.
- Trộn 3 phần RDE với 1 phần kháng huyết thanh, ủ ở nhiệt độ 37oC trong nồi đun cách thuỷ qua đêm.
- Ủ tiếp ở nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 56oC/30 phút để vô hoạt RDE còn dư.
- Kháng huyết thanh đã xử lý để nguội, cho thêm 6 phần nước sinh lý (0,3 ml kháng huyết thanh + 1,8 ml nước sinh lý), độ pha loãng cuối cùng của kháng huyết thanh là 1/10.
2.4.2.4. Phản ứng ngưng kết hồng cầu HA
- Nhỏ 25 àl PBS 0,01M vào đĩa TaKaShi 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 đến giếng thứ 12 của mỗi hàng.
- Cho 25 àl huyết thanh vào giếng thứ 1.
- Pha loóng khỏng nguyờn bằng cỏch chuyển 25 àl huyết thanh từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự đến giếng 11 thỡ bỏ đi 25 àl.
- Nhỏ thờm 25 àl PBS vào mỗi giếng.
- Nhỏ 25 àl hồng cầu gà 1% vào tất cả cỏc giếng trờn.
- Lắc đĩa bằng máy hoặc bằng tay
- Để đĩa TaKaShi ở nhiệt độ phòng 20oC, thời gian khoảng 20 - 30 phút.
- Đọc kết quả: Hiệu giá HA của virus được tính ở độ pha loãng cao nhất vẫn có hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
Ví dụ: Nếu ở độ pha loãng 1/128 còn có ngưng kết thì hiệu giá HA là 1/128.
Nếu phản ứng HA (+) dương tính, chứng tỏ có virus. Tiếp tục giám định bằng phản ứng HI với kháng huyết thanh chuẩn của một số subtype H virus cúm A và kháng huyết thanh chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập (Bộ NN và PTNT, 2005) [3].
2.4.2.5. Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI
Theo Bộ NN và PTNT (2005) [3], cách tiến hành phản ứng HI như sau:
- Pha khỏng nguyờn 4 HA/25 àl: lấy độ pha loóng cuối cựng cú phản ứng ngưng kết hồng cầu nhân với 4.
- Tiến hành phản ứng HI: Trên 1 đĩa TaKaShi có thể tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết thanh của các subtype khác nhau.
+ Nhỏ 25 àl PBS vào cỏc giếng của đĩa TaKaShi.
+ Nhỏ tiếp 25 àl khỏng huyết thanh vào giếng đầu tiờn.
+ Pha loóng khỏng huyết thanh theo cơ số 2, bằng cỏch chuyển 25 àl khỏng huyết thanh từ giếng 1 sang giếng 2 và tuần tự đến giếng 11 và bỏ đi 25 àl cuối cựng.
+ Nhỏ 25 àl khỏng nguyờn 4 HA đó chuẩn bị vào cỏc giếng từ giếng 1 - 11. Thờm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12).
+ Lắc đĩa và để ở nhiệt độ phòng 20 - 30 phút.
+ Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu (1%) vào tất cả cỏc giếng của đĩa.
+ Lắc đều, để đĩa ở nhiệt độ phòng 40 phút.
- Đọc kết quả: phản ứng dương tính (+) nếu hồng cầu lắng xuống đáy. Như vậy, virus phân lập và kháng huyết thanh chuẩn tương ứng với nhau.
Theo quy định 1361/KTY - DT ngày 02/12/2005 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn:
Ngưỡng bảo hộ: hiệu giá (HI) = 4 log2. Kháng thể cao: hiệu giá (HI) > 4 log2.
Không được bảo hộ: hiệu giá (HI) < 4 log2.
- Cách tính hiệu giá kháng thể: Hiệu giá kháng thể được tính ở độ pha loãng huyết thanh cao nhất còn có khả năng ngăn trở ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Độ pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, tức là: lần 1 là 1/2 tương ứng với 1 log2, lần 2 là 1/4 tương ứng với 2 log2, lần 3 là 1/8 tương ứng với 3 log2, lần 4 là 1/16 tương ứng với 4 log2….
Mẫu huyết thanh sau khi tiêm vắc xin cúm gia cầm có hiệu giá kháng thể ≥ 4 log2 được coi là đạt mức bảo hộ. (Bộ NN & PTNT, 2005)[3]
Công thức tính tỷ lệ bảo hộ cá thể/tổng đàn:
Tỷ lệ bảo hộ (%) = Số mẫu đạt hiệu giá kháng thể bảo hộ
× 100
Tổng số mẫu
Một đàn nếu có tỷ lệ bảo hộ ≥ 70% được coi là được bảo hộ đàn.
2.4.2.6. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học, trên phần mềm Excel 2008.
Chương 3