CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học
Các hợp chất phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn được thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên 6 dòng tến bào ung thư, được thử nghiệm tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nguyên liệu
• Nguyên liệu:
Các dòng tế bào: KB (Human epidemoid carcinoma - ung thư biểu mô), Fl (Fibril sarcoma of uteus - Ung thư màng tử cung), RD (Rhabdo sarcoma -Ung thư màng tim), LU (Human Lung carcinoma - Ung thư phổi ở người), SW480 (Human colon adenocarcinoma cell line - Ung thư tuyến đại tràng ở người), LNCaP (Human prostatic carcinoma -ung thư tiền liệt tuyến người).
Môi trường nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) có bổ sung L-glutamine, sodium piruvat, sodium bicacbonat; fetal bovine serum;
Hóa chất khác: DMSO, trichloroacetic acid, phosphate buffered saline, sulforhodamine B, acetic acid, tris base, trypsin.
Chất đối chứng dương tính: Ellipticine.
Thiết bị: Tủ ấm CO2, tủ lạnh sâu - 840C, tủ lạnh thường, máy li tâm, máy đọc Elisa; Box Laminar PII, bình nitơ lỏng, cân phân tích, máy đo pH, buồng đếm tế
bào, kính hiển vi soi ngược, bình nuôi cấy tế bào, các typ dùng 1 lần (phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, các đầu tip cho micropipet…)
Phương pháp
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
• Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) cùng với 2 mM L- glutamine, 1,0 mM sodium pyruvate và fetal bovine serum 10%.
• Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ 1:3 và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.
Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Nguyên lý của phương pháp
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) [114] nhằm xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B. Giá trị OD tỉ lệ thuận với lượng sulforhodamine B gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều thì giá trị OD càng lớn.
Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
Chất thử được pha trong DMSO 10%, sau đó đưa vào các giếng của khay 96 giếng để cú dải nồng độ 0,8; 4; 20 và 100 àg/mL. Trypsin húa tế bào thớ nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. Thờm vào cỏc giếng thớ nghiệm lượng tế bào phự hợp trong 180 àl mụi trường và để phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng cú tế bào ung thư (180àL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0.
Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng trichloracetic acid.
Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng trichloracetic acid trong 30 phút, được nhuộm bằng sulforhodamine B trong 1
giờ ở 37 oC. Đổ bỏ sulforhodamine B và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, sử dụng 10 mM tris base để hòa tan lượng sulforhodamine B đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA (Bio- Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm sulforhodamine B qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] × 100
% sống sót =
OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0) % ức chế = 100% - % sống sót
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 0,08, 0,4, 2, 10 àg/mL. DMSO 10% được sử dụng như đối chứng õm.
2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng lao
Hoạt tính kháng lao được thử nghiệm tại Phòng Hợp chất tự nhiên, Đại học Osaka, Nhật bản.
Các hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn được thử hoạt tính kháng lao trên chủng vi khuẩn Mycobacterium bovis (BCG) và Mycobacterium smegmatis bằng phương pháp MABA (microplate alamar blue assay: phép thử vi lượng sử dụng thuốc nhuộm xanh Alamar) [115].
Nguyên tắc của phương pháp:
Dựa vào quá trình phát triển của vi khuẩn Lao làm diễn ra quá trình oxi hóa khử làm thuốc thử Alamar blue phát huỳnh quang. Đo ở bước sóng kích thích 530 nm và bước sóng phát xạ 590 nm. Đọc kết quả sau 7 ngày.
Giá trị MIC của chất thử hoạt tính được xác định là nồng độ thấp nhất không gây phát huỳnh quang tương
Phương pháp tiến hành:
Chủng vi khuẩn lao được phát triển trong môi trường Middlebrook 7H9 đã được bổ xung thêm 0,2% glycerol (v/v), 0,05% tween-80 và dịch nuôi 10% (v/v)
(gồm: oleic acid, albumin, dextrose, catalase). Môi trường nuôi cấy này được ly tâm với tốc độ 3150 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC được rửa lại 2 lần, hòa lại trong đệm phosphat saline. Dịch tế bào được lọc qua màng lọc, kớch thước 8 àm, sau đú được lưu giữ ở -80oC.
Mẫu thử được hòa tan trong DMSO ở nồng độ 10 mg/mL, sau đó pha loãng thành dóy cỏc nồng độ dựng cho thớ nghiệm từ 2 -128 àM. Mẫu thử được pha loóng 2 lần trong mụi trường Middlebrook 7H12, sau đú đưa 100 àl mẫu vào cỏc giếng trong đĩa 96 giếng sau đú thờm 100 àl dịch cú chứa chủng vi khuẩn lao. Đĩa được ủ trong 7 ngày ở 370C với ỏp suất thường. Ngày thứ 7 thờm 12,5 àl tween-80 20%
và 20 àl thuốc thử Alamar blue vào mỗi giếng. Ủ tiếp ở 370C trong 16-24 giờ.
Mức độ huỳnh quang của mỗi giếng được đọc ở bước sóng kích thích 530 nm và bước sóng phát xạ 590 nm.
Giá trị MIC được xác định là nồng độ thấp nhất không gây phát huỳnh quang tương quan đến 90% so với giếng điều khiển không có vi sinh vật.
2.4.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
Hoạt tính chống oxi hóa được thử nghiệm tại: Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp diệt gốc tự do DPPH.
Nguyên tắc của phương pháp:
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp phụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống oxi hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp phụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm [116].
Phương pháp tiến hành:
Phương pháp sàng lọc sơ bộ khả năng bẫy gốc tự do trên phiến 96 giếng.
Tiến hành như sau:
Chuẩn bị mẫu thí nghiệm:
Tạo dung dịch cú cỏc gốc tự do: DPPH được pha 300 àM trong ethanol.
Mẫu đối chứng dương tính 5 mM acscorbic acid Tiến hành thí nghiệm:
Trộn mẫu và DPPH trên phiến 96 giếng.
Dóy thớ nghiệm: 10 àl mẫu +190 àl DPPH trong ethanol.
Dóy đối chứng õm tớnh: 10 àl DMSO 10% +190 àl DPPH trong ethanol.
Dóy mẫu trắng (Blank): 10 àl mẫu +190 àl ethanol.
Dóy đối chứng dương tớnh: 10 àl mẫu +190 àl DPPH trong ethanol.
Phiến được bọc kín để tránh ánh sáng và ủ trong tủ ấm 37oC trong 2 giờ. Đọc kết quả trên máy Elisa bước sóng 515 nm
* Tính kết quả
- Tính giá trị khả năng bẫy các gốc tự do - SC%: Giá trị trung bình của SC%
được đưa vào chương trình Microsoft Office Excel để xử lý số liệu tìm ra % trung bình độ lệch chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức:
OD thí nghiệm - OD mẫu trắng
SC% = [100 - × 100] ± σ OD chứng âm tính
Độ lệch tiêu chuẩn σ tính theo công thức của Ducan như sau:
Σ (xi - x )2
σ =
n - 1
Giá trị hoạt động SC% >50% mẫu được coi là có biểu hiện hoạt tính sẽ được chọn ra để tìm giá trị IC50.
Tìm giá trị ức chế EC50
Pha mẫu theo 5 thang nồng độ, giá trị IC50 được đưa vào chương trình Table Curve, thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử tính ra nồng độ của chất thử nghiệm mà ở đó 50% các gốc tự do được tạo bởi DPPH được trung hoà bởi chất thử theo công thức:
1 a b.ln X Y = +
Trong đó: Y: Nồng độ chất thử; X: Giá trị SC (%).
2.4.4. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được từ cây dấu dầu lá nhẵn, được tiến hành theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck [117] trên các phiến vi lượng 96 giếng, tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
* Nguyên liệu:
Mẫu thử được chuẩn bị theo một quy trình được xây dựng thống nhất tại Viện Công nghệ sinh học.
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
Vi khuẩn Gr (+): Staphylococcus aureus; Bacillus subtillis; Lactobacillus fermentum.
Vi khuẩn Gr (-):Salmonella enterica; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa.
Nấm mốc: Aspergillus niger; Fusarium oxysporum.
Nấm men: Candida albicans; Saccharomyces cerevisiae.
Kháng sinh kiểm định: Ampicilin đối với vi khuẩn Gr (+); tetracylin đối với vi khuẩn Gr (-); nystatin đối với nấm sợi và nấm men.
Cách pha kháng sinh:
Kháng sinh pha trong DMSO với nồng độ: ampixilin: 50mM, tetracylin:
10mM, nystatin: 0,04mM Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth đối với nấm men và nấm mốc; Trypcase Soya Broth đối với vi khuẩn.
Môi trường thí nghiệm: Eugon broth đối với vi khuẩn và Myco phil đối với nấm.
Phương pháp tiến hành:
- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được tiến hành trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) [117], đang được áp dụng tại trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.
Bước1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính Chuẩn bị vi sinh vật:
Nấm được duy trì trong môi trường dinh dưỡng đã nêu ở phần nguyên liệu và phương pháp. Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đó được pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland.
Chuẩn bị mẫu thử:
- Hoà tan các chiết phẩm trong dung dịch DMSO bằng máy Vortex với nồng độ 4-10 mg/ml.
- Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng, mỗi giếng 10 àl mẫu.
- Nhỏ vào mỗi giếng đó cú mẫu sẵn 190 àl vi sinh vật đó hoạt hoỏ.
Đối chứng dương: Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định.
Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật kiểm định.
- Để trong tủ ấm 37oC/24 giờ đối với vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm.
- Đọc kết quả:
Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, không có vi sinh vật phát triển, giống như hình ảnh ở các giếng chứng âm tính. Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các hợp chất có hoạt tính:
Các bước tiến hành như bước 1: các mẫu dương tính ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị ức chế tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.