CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Phân l ập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn
3.1.2. Phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn
Vỏ cây dấu dầu lá nhẵn được phơi khô, nghiền nhỏ thu được 2,4 kg bột. Bột này được ngâm chiết trong methanol (3 lít× 3 lần) và sử dụng thiết bị chiết siêu âm (50oC, 3 h). Các phần dịch chiết được gom lại lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi thu được 287,0 g cặn chiết methanol. Cặn chiết được hòa tan vào 3 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane, ethyl acetate (3 ×3 lít). Các dịch
chiết n-hexane, ethyl acetate được cất thu hồi dung môi thu được các cặn dịch tương ứng n-hexane (V-H, 91,0 g), ethyl acetate (V-E, 132,0 g) và lớp nước (V-N).
Cặn chiết ethyl acetate (52,0 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu ethyl acetate sau đó được tẩm vào 200,0 g silica gel. Tiến hành phân tách bằng cột silica gel pha thường và rửa giải với gradient hệ dung môi n-hexane/acetone (từ 50/1 → 1/1) thu được 4 phân đoạn chính là V-E1 (33,0 g), V-E2 (8,2 g), V-E 3 (8,0 g), V-E 4 (37,0 g).
V-E1 (33,0 g) được hòa tan với một lượng tối thiểu ethyl acetate sau đó tẩm vào 70,0 g silica gel, cất thu hồi dung môi cho đến khi thu được hỗn hợp bột khô tơi. Tiến hành phân tách bằng cột silica gel pha thường sau đó rửa giải với gradient hệ dung môi n-hexane/acetone ( 8/1 → 10/1) thu được 4 phân đoạn chính là V-E1A (15,0 g), V-E1B (3,0 g), V-E1C (2,1 g), V-E1D (18,0 g).
V-E1A được phân tách trên cột nhồi silicagel pha thường với hệ dung môi n- hexane/ethyl acetate (1/1) thu được ba phân đoạn V-E1A1 (2,0 g), V-E1A2 (3,7 g), V-E1A3 (2,0 g). V-E1A2 tiếp tục được phân tách trên cột silicagel pha đảo (YMC RP 18) với hệ dung môi acetone/nước (5/1) thu được hợp chất TG17 (10 mg). V- E1A3 được phân tách trên cột nhồi silicagel pha đảo với hệ dung môi acetone/nước (3/1) thu được hợp chất TG9 (9 mg). V-E1D được phân tách trên cột silicagel pha thường với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (6/1) thu được bốn phân đoạn V- E1D1 (1,0 g), V-E1D2 (4,6 g), V-E1D3 (1,8 g), V-E1D4 (2,0 g). Sau đó, từ V- E1D2 tiếp tục được phân tách trên cột nhồi silicagel pha đảo với hệ dung môi methanol/acetone/nước (3/1/1) thu được hợp chất TG18 (11 mg), TG19 (13 mg), TG20 (10 mg). V-E1D3 được phân tách trên cột nhồi silicagel pha đảo với hệ dung môi acetone/methanol/nước (1/8/2), thu được hợp chất TG3 (9 mg), TG6 (11 mg).
V-E2 (8,2 g) được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexane/acetone/ethyl acetate (30/1/1) thu được hợp chất TG10 (13 mg) và TG24 (8 mg).
Hình 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ cây dấu dầu lá nhẵn.
V-E4 được phân tách trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải chloroform/methanol (30/1) thu được bốn phân đoạn V-E4A (11,0 g), V-E4B (6,3 g), V-E4C (2,8 g), và V-E4D (3,2 g). Từ V-E4A tiếp tục phân tách trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi n-hexane/acetone (4/1) thu được ba phân đoạn V- E4A1 (2,0 g), V-E4A2 (3,6 g), V-E4A3 (1,6 g). V-E4A2 được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là n-hexane/ethyl acetate (2/1) thu được hợp chất TG2 (11 mg) và TG4 (8 mg). V-E4B được phân tách trên cột nhồi silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (2/1) thu được bốn phân đoạn V-E4B1 (2,5 g), V-E4B2 (2,6 g), V-E4B3 (2,4 g) và V-E4B4 (2,0 g). V-E4B1 được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải là chloroform/acetone (15/1) thu được hợp chất TG25 (10 mg).
Lớp nước (V-N) được cho chạy qua cột sắc ký trao đổi ion với chất hấp phụ là diaion HP-20 và hệ dung môi rửa giải tăng dần nồng độ methanol trong nước (0, 25, 50, 75 và 100%) thu được bốn phân đoạn V-N1, V-N2 (21 g), V-N3 (12 g), V- N4 (15 g) V-N5 (8 g). V-N2 phân tách trên cột silicagel pha thường với hệ dung môi chloroform/methanol (15/1) thu được hợp chất TG26 (7 mg). Phân đoạn V-N4 (31 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi n-hexane/acetone (2/1) thu được hai hợp chất TG5 (15 mg) và TG7 (7 mg).
3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ LIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN
3.2.1. Hợp chất TG1 (hợp chất mới): Tetraglabrifolioside Chất bột màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 192-194oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = +32,1 (c = 0,3, MeOH).
HR-ESI-MS: m/z 379,1609 ([M–H]–).
Tính toán lý thuyết cho công thức C16H27O10: 379,1604.
CTPT: C16H28O10; KLPT M = 380.
Số liệu phổ 1H- NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem bảng 8.
3.2.2. Hợp chất TG2: 6-Acetonyl-N-methyldihydrodecarine Chất bột vô định hình, màu nâu.
Nhiệt độ nóng chảy: 187-189oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -9,3 (c = 0,02, CHCl3).
HR-ESI-MS: m/z 392,1493 ([M+H]+).
Tính toán lý thuyết cho công thức C23H22NO5: 392,1498.
CTPT: C23H21NO5; KLPT M = 391.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 9. 3.2.3. Hợp chất TG3: 6-Acetonyldihydrochelerythrine
Chất bột vô định hình, màu nâu.
Nhiệt độ nóng chảy: 192-195oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -128,2 (c = 0,02, CHCl3).
HR-ESI-MS: m/z 406,1654 ([M+H]+).
Tính toán lý thuyết cho công thức C24H24NO5: 406,1654.
CTPT: C24H23NO5; KLPT M = 405.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 10. 3.2.4. Hợp chất TG4: Decarine
Chất ở dạng tinh thể hình kim, màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 243-244oC.
CTPT: C19H13NO4; KLPT M = 319.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 11. 3.2.5. Hợp chất TG5: Iwamide
Chất bột vô định hình, màu nâu.
Nhiệt độ nóng chảy: 271-273oC.
CTPT: C20H17NO6; KLPT M = 367.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 12.
3.2.6. Hợp chất TG6: Rutaecarpine
Chất bột dạng vô định hình, màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 260-261oC.
HR-ESI-MS: 288,1107 ([M+H]+).
Tính toán lý thuyết cho công thức C18H14N3O(288,1131).
CTPT: C18H13N3O; KLPT M = 287.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 13.
3.2.7. Hợp chất TG7: 12α-Hydroxyevodol Chất bột dạng vô định hình mầu vàng nhạt.
Nhiệt độ nóng chảy: 283-284oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -113,7 (c = 0,5, MeOH).
CTPT: C26H28O10; KLPT M = 500.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 14.
3.2.8. Hợp chất TG8: Rutaevine
Chất ở dạng tinh thể mầu không mầu.
Nhiệt độ nóng chảy: 300-301oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -149,6 (c = 0,005, CHCl3).
CTPT: C26H30O9; M = 486.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 15.
3.2.9. Hợp chất TG9: Lupeol Chất ở dạng tinh thể mầu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 215-216oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = +26,4 (c =0,5 CHCl3).
CTPT: C30H50O; KLPT M= 426.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 16. 3.2.10. Hợp chất TG10: Friedelan-3-one
Chất ở dạng tinh thể mầu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 267-268oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = +29,5 (c =0,1 CHCl3).
CTPT: C30H50O; KLPT M=426.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 17. 3.2.11. Hợp chất TG11: Phellamurin
Chất rắn, mầu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy 204-205oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -21,4 (c =0,2 MeOH).
CTPT: C26H28O11; KLPT M =518.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 18.
3.2.12. Hợp chất TG12: Epimedoside C Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 289oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -92,4 (c =0,05, MeOH).
CTPT: C26H28O11; KLPT M=516.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 19. 3.2.13. Hợp chất TG13: Astragalin
Chất tinh thể hình kim, mầu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy 178-179oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = +16,9 (c =0,65, MeOH) ESI-MS: m/z 477 [M+H]+ và 471 [M+Na]
CTPT: C21H20O11; KLPT M =448;
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 20. 3.2.14. Hợp chất TG14: Nicotiflorin
Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 190-192oC.
Độ quay cực [𝛼]𝐷25 = +20,2 (c = 0,5, MeOH);
CTPT: C27H30O15; KLPT M =594;
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 21. 3.2.15. Hợp chất TG15: Trifoline
Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 229-231oC.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = +17,6 (c =0,5, MeOH).
CTPT: C21H20O11; KLPT M=448.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 22.
3.2.16. Hợp chất TG16: Quercetin
Chất ở dạng tinh thể hình kim màu vàng.
Nhiệt độ nóng chảy: 313-314oC.
CTPT: C15H10O7; KLPT M= 302.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem bảng 23.
3.2.17. Hợp chất TG17: α-Tocopherol Chất ở dạng dầu, mầu vàng.
Độ quay cực [𝛼]𝐷25 = +26,4o (c= 0,5, CHCl3).
CTPT: C29H50O2; KLPT M =430;
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 24.
3.2.18. Hợp chất TG18: N-Isobutyl-2E,4E-tetradecadienamide Chất ở dạng dầu, không màu.
HR- ESI-MS: m/z 280,2640 [M+H]+.
Tính toán lý thuyết cho công thức C18H34NO: 280,2640.
CTPT: C18H33NO; KLPT M = 279.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 25.
3.2.19. Hợp chất TG19: N-Isobutyl-2E,4E-decadienamide Chất bột mầu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 87-88oC.
CTPT: C14H25NO; KLPT M = 223.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem bảng 26. 3.2.20. Hợp chất TG20: N-Isobutyl-2E,4E,8E-tetradecatrienamide
Chất ở dạng dầu, không màu;
HR ESI-MS: m/z 278,2483 [M+H]+.
Tính toán lý thuyết cho công thức C18H32NO: 278,2483.
CTPT: C18H31NO; M = 277.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 27. 3.2.21. Hợp chất TG21: Syringin
Tinh thể màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 191-192oC.
Độ quay cực [𝛼]𝐷25 = −20,2o (c= 0,5, MeOH).
CTPT: C17H24O9; KLPT M= 372.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem bảng 28.
3.2.22. Hợp chất TG22: Saikolignannisode A Chất bột màu vàng nhạt.
Nhiệt độ nóng chảy: 110-112oC.
Độ quay cực [𝛼]𝐷25 = +25,3 (c = 0,5, MeOH);
CTPT: C26H34O11; KLPT M= 522.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem bảng 29.
3.2.23. Hợp chất TG23: Picraquassioside D Chất bột màu trắng.
Độ quay cực [𝛼]𝐷25 = −70,4 (c =0,5, MeOH).
ESI-MS: m/z 303 [M+H]+. CTPT: C13H18O8 và M= 302.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem bảng 30.
3.2.24. Hợp chất TG24: Stigmatsterol
Chất ở dạng tinh thể hình kim mầu trắng.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -54,2 (c = 1,9 CHCl3).
Nhiệt độ nóng chảy: 170oC.
ESI-MS: m/z: 395,3 [M -H2O+H]+.
Tính toán lý thuyết cho công thức: C29H48O.
CTPT: C29H48O, KLPT M= 412,00.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CDCl3): xem bảng 31. 3.2.25. Hợp chất TG25: Daucosterol
Chất bột mầu trắng.
Độ quay cực: [𝛼]𝐷25 = -41,2 (c = 1,9 CHCl3).
Nhiệt độ nóng chảy: 283-284oC.
ESI-MS: m/z: 397,3 [M -C6H12O6+H]+. Tính toán lý thuyết cho công thức: C35H60O6. CTPT: C35H60O6; M = 576.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (DMSO-d6): xem bảng 32.
3.2.26. Hợp chất TG26: 5-Hydroxymethylfurfural Chất ở dạng dầu mầu vàng.
CTPT: C6H6O3; KLPT M = 126.
Số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (CD3OD): xem bảng 33.