CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu
Theo phương pháp của FDA, USP, WHO, ISO guide 35, ISO 13528 và ISO 17043 cũng như mô hình của các nhà cung cấp chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu như:
Chromadex, Sigma Aldrich, Cerilliant... bao gồm các bước sau: đánh giá các yêu cầu ưu tiên và khẳng định nhu cầu, nghiên cứu tài liệu và lập kế hoạch, phân lập nguyên liệu và tinh chế, xác định đặc tính lý hóa, đánh giá đồng nhất, thiết lập báo cáo phân tích và chứng chỉ phân tích [20], [29], [47].
Áp dụng phương pháp khảo sát liên phòng thí nghiệm để xác định hàm lượng chất chuẩn đối chiếu theo ISO guide 35. Phương pháp xác định tạp chất hữu cơ là HPLC ghép với đầu dò dãy diod quang sau khi đã thẩm định. Áp dụng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng theo USP 2007 [116] để xác định tạp chất bay hơi, phương pháp plasma cảm ứng để xác định tạp chất vô cơ (Pb, As, Hg) theo Dược điển Trung quốc 2010 [41].
2.4.2.1. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất chuẩn đối chiếu điều chế
So sánh các phổ UV-Vis, IR, MS, NMR của chất chuẩn đối chiếu điều chế được với phổ liên kết chuẩn trong cùng điều kiện thí nghiệm. Nếu không sẵn có chất chuẩn đối chiếu đã được thiết lập để liên kết thì so sánh với các phổ tương ứng ghi trong tài liệu đã công bố, thư viện phổ và/hoặc xác định cấu hình tuyệt đối bằng kỹ thuật nhiễu xạ tia X nếu phân tử ở dạng tinh thể.
2.4.2.2. Đánh giá chất chuẩn đối chiếu điều chế
Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích xác định tạp chất hữu cơ [26], [44], [82], [103]
Dựa vào tính phân cực/không phân cực của các chất cần phân tích, xây dựng phương pháp HPLC phát hiện bằng đầu dò dãy diod quang (HPLC-DAD) để xác định tạp chất hữu cơ chưa biết khi không định danh được tạp hoặc không có tạp chuẩn bằng phương pháp phần trăm diện tích:
Khảo sát các cột pha đảo RP C18 như: Shim-pack VP-ODS, Gemini NX C-18, Zorbax C-18.
Khảo sát pha động về thành phần, tỷ lệ và chương trình. Khảo sát các hệ dung môi acetonitril-nước, dung dịch acid acetic 0,1-2%; methanol-nước, dung dịch acid acetic 0,1-2%.
Khảo sát nhiệt độcột ở: 25, 30 và 40oC.
Khảo sát tốc độdòngở0,6; 0,8 và 1 ml/phút.
Khảo sát bước sóng phát hiện để thu được hàm lượng tạp chất là cao nhất tính theo phương pháp phần trăm diện tích.
Khảo sát nồng độdung dịch hợp chất phenol đủnhạy đểphát hiện được tất cảtạp và pic chính vẫn nằm trong khoảng tuyến tính để không làm sai lệch khi tính kết quả.
Thẩm định phương pháp phân tích, vận dụng theo hướng dẫn của ICH: thử tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, giới hạn phát hiện.
Xác định tạp chất bay hơi bằng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng Tốc độ gia nhiệt: 6oC/phút.
Khoảng nhiệt độ: 30-150oC.
Khí: Nitrogen.
Tốc độ dòng: 100 ml/phút.
Xác định tạp chất vô cơ (Pb, As, Hg) bằng phương pháp ICP-MS Tốc độ khí nebulizer: 0,55 l/phút.
Tốc độ khí plasma: 15 l/phút.
Dwell: 15 ms.
Đồng vị theo dõi: As: 75; Pb: 208, 206; Hg: 202.
2.4.2.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn đối chiếu
Dựa vào hướng dẫn của WHO, ISO, xây dựng chỉ tiêu chất lượng và phương pháp đánh giá chất đối chiếu hóa học dùng cho định lượng bao gồm:
Bảng 2.1.Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn đối chiếu theo WHO
Chỉ tiêu Phương pháp thử
Cảm quan Quan sát bằng mắt
Định tính UV-Vis; IR; MS; NMR; X-Ray
Điểm chảy Dược điển
Độ tinh khiết
- Tạp chất hữu cơ HPLC-DAD
- Nước và các chất hữu cơ bay hơi TGA
- Kim loại nặng ICP-MS
Định lượng Dược điển hoặc không dược điển
Độ tinh khiết (Tạp chất hữu cơ) được đánh giá ở tối thiểu 3 phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025: 2005 và/hoặc GLP để xác định giá trị ấn định, độ lệch chuẩn và độ không đảm bảo đo [83], [84]. Sau cùng, xây dựng chứng chỉ phân tích cho hợp chất phenol phân lập được dùng làm chất đối chiếu dựa vào các tài liệu quốc tế về chất chuẩn, chất đối chiếu [20], [29], [42], [47].