CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
D: Thời gian siêu âm (phút)
3.8.2. Thẩm định phương pháp phân tích
Chuẩn bị dung dịch chất đối chiếu calophyllolid trong methanol (TT) có nồng độ 59,2 g/ml. Tiêm vào hệ thống sắc ký theo phương pháp phân tích đã xây dựng 6 lần. Tính các thông số sắc ký: thời gian lưu, %RSD của diện tích, hệ số đối xứng và số đĩa lý thuyết của pic calophyllolid. Kết quả ghi trong bảng 3.25.
Bảng 3.25. Tínhphù hợp của hệ thống HPLC-DAD (n = 6)
Thông số Yêu cầu Kết quả
Thời gian lưu (phút) _ 29,5
Hệ số đối xứng 0,8-1,5 1,2
%RSD diện tích pic ≤ 2,0 1,65
Số đĩa lý thuyết ≥ 2000 254523
Tính đặc hiệu
Tiêm vào máy sắc ký lần lượt các mẫu sau: Dung môi hòa tan mẫu: dung dịch methanol 90%; dung môi pha động; dung dịch chất đối chiếu calophyllolid trong methanol (TT); dung dịch thử trong dung môihòa tan mẫu.
Hình 3.30. Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng calophyllolid trong dầu Mù u INOPILO
Hình 3.31. Phổ UV và độ tinh khiết pic calophyllolid trong mẫu thử dầu Mù u INOPILO
Hình 3.32.Phổ 3D của calophyllolid trong Hình 3.33. Sắc ký đồHPLC của mẫu
mẫu thửdầu Mù u INOPILO thửdầu Mù u INOPILO
Dung môi hòa tan mẫu
Dung môi pha động Mẫu chuẩn
Mẫu thử
Kết quả:
- Sắc ký đồ pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện tín hiệu trùng với thời gian lưu của calophyllolid trong mẫu thử và mẩu đối chiếu.
- Độ tinh khiết của pic calophyllolid trong sắc ký đồ mẫu thử: 0,999 (> 0,99).
- Độ phân giải giữa pic calophyllolid và các pic liền kề trong sắc ký đồ mẫu thử:
1,52 và 1,58 ( ≥ 1,5).
Nhận xét:Phương pháp đạt yêu cầu về tính đặc hiệu.
Tính tuyến tính
Có tương quan tuyến tính giữa nồng độ calophyllolid và diện tích pic của các dung dịch đối chiếu calophyllolid: 29,6-88,8 àg/ml và cỏc dung dịch calophyllolid trong mẫu thử: 31,2-84,7 àg/ml với hệ số tương quan lần lượt là 0,9998 và 0,9999 (r ≥ 0,995).
Bảng 3.26.Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của calophyllolidtrong phương pháp HPLC-DAD
Dung dịch chất đối chiếu calophyllolid
Diện tích pic (A) (àV.s)
343587 515919 686280 843388 1058381
Nồng độ(C) (àg/ml)
29,6 44,4 59,2 71,0 88,8
Hệ số đáp ứng (A/C)
11608 11620 11593 11879 11919
Phương trình hồi quy: y
= 12112,5X–20280,7 r = 0,9998
Dung dịch mẫu có chứa
calophyllolid
Diện tích pic (A) (àV.s)
365105 504192 695425 804107 991236
Nồng độ(C) (àg/ml)
31,2 43,1 59,4 68,7 84,7
Hệ số đáp ứng (A/C)
11702 11698 11707 11705 11703
Phương trình hồi quy: y
= 11706X -144,6 r = 0,9999
Hình 3.34.Đồ thị tương quan giữa nồng độ các dung dịch đối chiếu(1), dung dịch mẫu thử(2)và diện tích piccalophyllolid
Tiến hành trắc nghiệm t bắt cặp cho kết quả t = 0,29 < t0,05= 2,776. Hệ số đáp ứng của calophyllolid trong các dung dịch mẫu đối chiếu và mẫu đối chiếu có tá dược không khác nhau có ý nghĩa thống kê ở P = 0,05. Tá dược không làm ảnh hưởng đến tính tuyến tính của calophyllolid trong khoảng nồng độ khảo sát.
Nhận xét:Phương pháp đạt yêu cầu về tính tuyến tính.
y
=12112,5X–20280,7 r = 0,9998
Nồng độ(àg/ml) Diện tớch pic (àV.s)
Nồng độ(àg/ml) Diện tớch pic (àV.s)
(1)
(2)
y
=11706X–144,6 r = 0,9999
Độ chính xác
Tiến hành định lượng 6 mẫu thử ở nồng độ định lượng bởi 2 kiểm nghiệm viện trong 2 ngày khác nhau. Xác định hàm lượng phần trăm calophyllolid (g/100 g).
Tínhđộ lệch chuẩn, %RSD và khoảng tin cậy của các kết quả định lượng thu được này.
Bảng 3.27. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phươngpháp HPLC-DAD
Stt Kiểm nghiệm viên 1 Kiểm nghiệm viên 2
Diện tích pic (àV.s)
Hàm lượng%
(g/100 g)
Diện tích pic (àV.s)
Hàm lượng%
(g/100 g)
1 695425 0,47 584530 0,47
2 700263 0,47 586515 0,47
3 677470 0,46 603457 0,47
4 678107 0,46 773898 0,48
5 684804 0,46 785385 0,50
6 704659 0,48 780604 0,49
Ngày 1 Ngày 2 So sánh
phương sai
So sánh giá trị trung bình
Trung bình: 0,47 ± 0,01%
SD: 0,0082
%RSD: 1,75
Trung bình: 0,48 ± 0,01%
SD: 0,0126
%RSD: 2,64
F1-2= 2,4 < F0,05= 5,05 t1-2= 2,169 < t0,05= 2,228
Kết quả:
- Độlặp lại: %RSD: 1,75 (< 3,0)
- Kết quả giữa các ngày khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P = 0,05)
Nhận xét:Phương pháp đạt yêu cầu chỉ tiêu độlặp lại và độchính xác trung gian
Độ đúng
Thêm chính xác một lượng chất đối chiếu calophyllolid vào mẫu thử đã biết trước hàm lượng để thu được dung dịch mẫu có nồng độ tương ứng với 3 mức nồng độ 80, 100 và 120% so với mức nồng độ định lượng đã chọn và nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập.Xác định hàm lượng calophyllolid để tính tỷ lệ phần trăm giữa lượng tìm thấy so với lượng thêm vào.
Bảng3.28.Kết quả độ đúng của phương pháp HPLC-DAD Lượngthờm vào (àg) Lượng tỡmthấy (àg) Tỷ lệ phục hồi(%)
80%
482,4 482,4 100,0 ± 0,8
483,8 484,1 100,1 ± 0,8 %RSD = 0,32
495,2 498,1 100,6 ± 0,8
100%
633,4 656,3 103,6 ± 3,87
632,7 644,3 101,8 ± 3,87 %RSD = 1,53
635,4 638,7 100,5 ± 3,87
120%
746,3 765,7 102,6 ± 0,87
721,8 742,7 102,9 ± 0,87 %RSD = 0,34
733,2 757,3 103,3 ± 0,87
Trung bình 101,71 ± 1,1 %RSD = 1,41 Kết quả:
- Độ đúng: 101,71 ± 1,1% (97-103%); %RSD: 1,41 (≤ 2,0) Nhận xét:Phương pháp đạt yêu cầu chỉ tiêu độ đúng.