3.1. Lá cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis)
3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
Lá cây Cách hoa đông dương (C. indochinensis) sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ thành bột (0,96 kg). Bột mẫu lá được ngâm chiết với CH2Cl2 5 lần (24 giờ/ lần) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được 28,8 g và 80 g các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng. Quá trình ngâm chiết được thể hiện trong hình 3.1.
Hình 3.1: Sơ đồ ngâm chiết lá cây Cách hoa đông dương
Cặn chiết CH2Cl2 của lá cây Cách hoa đông dương (28,8 g) được phân tách sơ bộ trên cột silica gel (190 g silica gel) với hệ dung môi rửa giải là n- hexan/EtOAc bắt đầu từ 5% EtOAc sau đó tăng dần đến 100 % EtOAc để thu được 80 phân đoạn nhỏ (mỗi phân đoạn từ 100-120 ml dung môi), gộp các
Lá cây (0,96 kg) C. indochinensis
Cặn CH2Cl2
28,8 g Bã còn lại
Cặn MeOH
80 g Bã còn lại
- Ngâm chiết CH2Cl2 (5 lần x 24 h) - Cất loại dung môi
- Ngâm chiết MeOH (24 h/lần) - Cất loại dung môi
phân đoạn bằng cách kiểm tra trên TLC nhận được 20 phân đoạn thô được ký hiệu từ CLF1 đến CLF 20.
Phân đoạn CLF2 (11,2 g) được đưa lên cột silica gel, dung môi là n- hexan/ CH2Cl2nhận được 4 phân đoạn nhỏ, ở phân đoạn CLF2.1 tinh chế lại một lần nữa trên cột silica gel dung môi là 100 % n-hexan thu được 27 mg một chất dầu ký hiệu là CLF2.1 (12 mg).
Phân đoạn CLF 6 có khối lượng 2,36 g được hòa lại trong n-hexan, phần chất rắn không tan có khối lượng 0,4 g được phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi là n-hexan/CH2Cl2 (6: 4) thu được 6 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn nhỏ CLF 6.3 kết tinh thu được 1 chất sạch ký hiệu là CLF6.3 (16 mg) và phân đoạn CLF 6.4 được tinh chế lại bằng sắc ký bản mỏng điều chế thu được 2 mg chất rắn ký hiệu CLF6.4.
Phân đoạn CLF3 (3,54 g) được đưa lên cột silica gel, dung môi rửa giải là n-hexan/CH2Cl2 bắt đầu từ (8,5:1,5) thu được 25 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn CLF3.1, CLF3.14 và phân đoạn F3.20 kết tinh lại trong hệ n-hexan/axeton và etanol thu được tương ứng hợp chất CLF3.1 (12 mg), hợp chất CLF3.14 (23 mg) và hợp chất CLF 3.20 (15 mg).
Gộp phân đoạn CLF4 và CLF5 lại được 1,95 g, phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi là n-hexan/axeton, tăng dần từ 1,5% đến 20% axeton, nhận được 9 phân đoạn. Phân đoạn CLF4.6 kết tinh thu được hợp chất sạch là CLF4.6 (16 mg).
Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong hình 3.2.
Cặn chiết MeOH (80 g) được hòa lại trong hỗn hợp dung môi n- hexan/axeton (2,5:7,5), phần dung dịch cất loại dung môi được 20 g, ký hiệu là CLFM. Cặn này sau đó được phân tách trên 140 g silica gel, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2/MeOH (98,5:1,5 →50:50) thu được 14 phân đoạn, ký hiệu là CLFM1-CLFM14.
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập cặn CH2Cl2 của lá cây Cách hoa đông dương
Phân đoạn CLFM4-5 (1,68 g) được tinh chế trên cột silica gel, hệ dung môi là CH2Cl2/EtOAc (8,5:1,5), sau đó tăng dần EtOAc đến 100%. Ở phân đoạn CLFM 4.1 nhận được chất bột màu vàng sậm ký hiệu là CLFM4.1 (9 mg), còn ở phân đoạn CLFM 4.5 được tinh chế lại trên cột sephadex LH 20, dung môi là MeOH nhận được chất sạch, ký hiệu là CLFM4.5.1 (9 mg).
Phân đoạn CLFM 8 (400 mg) có phần không tan trong CH2Cl2, lọc và rửa lại bằng CH2Cl2, thu được một chất sạch ký hiệu là CLFM 8.1 (15 mg).
Dung dịch còn lại cô khô có khối lượng 380 mg được đưa lên tinh chế trên cột silica gel, hệ dung môi là CH2Cl2/axeton, thu được một chất sạch ký hiệu là CLFM8.1.1 (5 mg).
Phân đoạn F10 (1 g) được đưa lên cột pha đảo RP-18, hệ dung môi là H2O: MeOH (30 – 100% MeOH). Phân đoạn nhỏ FM10.3 được tinh chế lại
Cặn CH2Cl2 lá cây C. indochinensis 28,8 g
F4-5
CLF2.1 27 mg
- CC, SiO2
n-hexan: EtOAc, gradient
F1 F2 F3 F6 F7-11 F12-15 F16-20
F2.1
- CC, SiO2
n-hexan: CH2Cl2
- CC, SiO2
n-hexan
F3.1 F3.20
CLF3.20 15 mg CLF3.1
12 mg
- CC, SiO2
n-hexan: CH2Cl2
Kết tinh
Kết tinh
F4.6
CLF4.6 16 mg
CC, SiO2
n-hx: ax
Kết tinh
F6 tan F6 ko tan
Hoà lại n-hexan
F6.3 F6.4
CLF6.3 16 mg
CLF6.4 2 mg
Kết tinh TLC điều chế
- CC, SiO2
n-hexan: CH2Cl2
F3.14
CLF3.14 23 mg
Kết tinh
trên cột sephadex LH-20 dung môi là MeOH thu được chất sạch ký hiệu là CLFM10.3 (6 mg). Phân đoạn nhỏ FM10.6 có phần chất rắn không tan được rửa lại với CH2Cl2 thu được chất sạch là CLFM10.6 (7 mg).
Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong hình 3.3.
Hình 3.3: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của lá cây Cách hoa đông dương