3.2. Quả cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis)
3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách
Quả cây Cách hoa đông dương (C. indochinensis) sau khi thu hái được phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ thành bột (100 g). Bột mẫu quả được ngâm chiết với CH2Cl2 5 lần (24 giờ/lần) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được 4,0 g và 5,5 g các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng. Sơ đồ ngâm chiết quả cây Cách hoa đông dương được trình bày trong hình 3.4.
Hình 3.4: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Cách hoa đông dương
Cặn CH2Cl2 (4 g) được phân tách trên cột silica gel, dung môi là n-hexan:
aceton thu được 17 phân đoạn ký hiệu từ F1-F17. Phân đoạn F11 (150 mg) được kết tinh trong hỗn hợp n-hexan: CH2Cl2 thu được chất CLQF11 (95 mg).
Phân đoạn F12 (335 mg) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH (0 – 98% MeOH). Phân đoạn nhỏ F12.3 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 (MeOH:CH2Cl2,8: 2), sau đó tinh chế lại một lần nữa trên cột pha đảo RP-18, dung môi là MeOH: H2O (2:8 - 10:0), thu được CLQF12.3 (10 mg).
Quả cây (100 g) C.indochinensis
Cặn CH2Cl2
4,0 g Bã còn lại
Cặn MeOH
5,5 g Bã còn lại
- Ngâm chiết CH2Cl2 (24h/lần) - Cất loại dung môi
- Ngâm chiết MeOH (24h/lần) - Cất loại dung môi
Phân đoạn F14 và F15 được gộp lại (115 mg) và tinh chế trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (98:2) thu được 8 phân đoạn thứ cấp F15.1 đến F15.8. Phân đoạn F15.3 sau khi tinh chế trên cột sephadex LH 20 CH2Cl2: MeOH, (1,5:8,5) thu được hợp chất CLQF15.3 (5 mg).
Tương tự, phân đoạn F17 (400 mg) được phân tách trên cột silica gel, với hệ dung môi CH2Cl2: MeOH (95: 5) nhận được 5 phân đoạn nhỏ F17.1 đến F17.5. Phân đoạn F17.1 được tinh chế lại trên cột sephadex (MeOH) thu được chất CLQF17.1 (18 mg). Phân đoạn F17.2 được rửa với MeOH, thu được CLQF17.2 (10 mg).
Hình 3.5: Sơ đồ phân tách cặn CH2Cl2 của quả cây Cách hoa đông dương Cặn CH2Cl2
4,0 g
Chất rắn
F16.2
F1…F8 F9-10 F11 F12 F13 F14-15 F16 F17
Kết tinh n-hx: CH2Cl2
CLQF11 95 mg
F12.3
CLQF12.3 10 mg
F15.3
CLQF15.3 5 mg
- Sephadex, MeOH: CH2Cl2
MeOH: H2O - CC, SiO2
CH2Cl2: MeOH - CC, SiO2
CH2Cl2: MeOH
- Sephadex, MeOH - CC, RP-18 MeOH: H2O
F16A
β-sitosterol glucosid
- CC, SiO2
CH2Cl2: MeOH
Rửa = ete
CLQF16 7 mg
F17.1 F17.2
- CC, SiO2
CH2Cl2: MeOH
CLQF17.1 18 mg
CLQF17.2 10 mg
- Sephadex, MeOH MeOH: H2O
Rửa = MeOH
Phân đoạn F16 được rửa bằng CH2Cl2. Chất rắn không tan được xác định là β-sitosterol glucosid bằng cách đo điểm chảy và so sánh bằng TLC với chất β-sitosterol glucosid chuẩn có trong phòng thí nghiệm. Phần nước rửa được cất loại dung môi (40 mg) và được phân tách trên cột silica gel (CH2Cl2:MeOH, 97:3) thu được 3 phân đoạn nhỏ F16.1 đến F16.3. Phân đoạn F16.2 được rửa lại với ete thu được CLQF16 (7 mg). Quá trình phân tách cặn chiết CH2Cl2 được tóm tắt trong hình 3.5.
Cặn chiết MeOH (5,5 g) của quả cây Cách hoa đông dương được phân tách trên cột pha đảo RP-18 với hỗn hợp dung môi MeOH:H2O (5–100%
MeOH trong H2O), thu được 10 phân đoạn ký hiệu là FM1-FM10.
Phân đoạn FM2 (95 mg) được phân tách trên cột silica gel CH2Cl2:MeOH:HCOOH (91:7:2) thu được chất CLQFM2 (8 mg).
Hình 3.6: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của quả cây Cách hoa đông dương Cặn MeOH
5,5g
FM1 FM2 FM3 FM4 FM5-6 FM7
CLQFM2 8 mg
FM4.2 CLQFM4.5
5 mg
FM7.2
CLQFM7 5 mg
- Sephadex MeOH - CC, SiO2
CH2Cl2: MeOH - CC, RP-18
H2O: MeOH, grad
- CC, SiO2
CH2Cl2: MeOH: HCOOH
FM8-11
Chất rắn
Hoà tan MeOH
FM4.1 FM4.3
- CC, SiO2
CH2Cl2: MeOH
FM4.4
CLQF17.1 CLQF17.2 CLQFM4.3 6 mg
CLQFM4.4 10 mg
- Sephadex MeOH - Rửa = axeton Rửa = MeOH
Phân đoạn FM4 có phần chất rắn không tan trong MeOH, lọc phần không tan, rửa lại với MeOH nhận được CLQFM4.5 (5 mg). Phần dung dịch MeOH được cô lại và được phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (95:5) thu được 5 phân đoạn nhỏ FM4.1 đến F4.5. Phân đoạn FM4.3 được rửa bằng MeOH thu được CLQFM4.3 (6 mg). Phân đoạn FM4.4 được tinh chế lại trên cột sephadex (MeOH) nhận được CLQFM4.4 (10 mg).
Phân đoạn FM7 (55 mg) được tinh chế trên cột silica gel (CH2Cl2:MeOH, 97:3). Phân đoạn nhỏ FM7.2 được tinh chế tiếp trên cột sephadex LH 20 (MeOH) thu được CLQFM7 (5 mg) dưới dạng chất bột màu vàng.
Quá trình phân tách cặn MeOH của quả cây Cách hoa đông dương được trình bày trong hình 3.6.