CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Tách chiết DNA tổng số từ 11 loài tre thuộc chi Bambusa Schreb.
DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá hoặc thân của 11 loài tre nghiên cứu (1987) [20]. Tinh sạch DNA tổng số bằng bộ kít Genomic DNA Purification kit (#KO512, Fermentas). Sản phẩm DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,9%. Nhuộm gel bằng Ethidium bromide và soi dưới đèn UV. Xác định nồng độ DNA bằng máy đo quang phổ hấp phụ.
2.4.2. Thiết kế cặp mồi
Để thiết kế được cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp không đặc hiệu. Chúng tôi đã khai thác các dữ liệu trong ngân hàng gen Genbank để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho vùng gen matK và rpoC2 đối với chi Bambusa Schreb. Sau đó sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng để thiết kế cặp mồi. Cặp mồi matK19F/matKR nhân bản vùng gen matK được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide loài Bambusa chungii mã số HM448934 trên ngân hàng
Genbank. Cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2 nhân bản vùng gen rpoC2 được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide loài Bambusa oldhamii mã số FJ970915 trên ngân hàng Genbank. Quá trình thiết kế cặp mồi được thực hiện trên phần mềm DNAstar.
2.4.3. Phương pháp nhân bản PCR
Nhõn bản PCR và đọc trỡnh tự: Mỗi phản ứng PCR cú thể tớch 25àl với cỏc thành phần: 13 àl H2O deion; 2,5 àl buffer 10X; 1 àl MgCl2 25mM; 2,5 àl dNTPs 2,5mM; 1,25 àl mồi xuụi (10 pmol); 1,25 àl mồi ngược (10 pmol); 0,5 àl Taq polymerase (5U/àl); 3 àl DNA. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94C trong 3 phút; 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 94C trong 50 giây, 50 đến 55C trong 55 giây (nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi như trong bảng 1), 72C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4C.
2.4.4. Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình tự.
Quá trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,9%, cắt lấy phân đoạn DNA quan tâm trên bàn soi UV và tinh sạch bằng bộ KIT QIAquick Gel Extraction của QIAGEN. Kiểm tra sản phẩm thu được trên gel agarose 0,9%. Chụp ảnh sản phẩm thôi gel và xác định hàm lượng DNA để gửi đi xác định trình tự.
2.4.5. Xác định trình tự nucleotide các đoạn DNA
Trình tự nucleotide được xác định bằng kỹ thuật xác định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
2.4.6. Phân tích số liệu
Xử lý số liệu: Dữ liệu được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng BioEdit, Mega 4.0, Clustal X 2.1, DNAstar,…vv. Trình tự nucleotide của 11 loài nghiên cứu được so
sánh với các trình tự của vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF đã công bố trên Genbank.
Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Có 4 phương pháp tạo cây bao gồm: (1) phương pháp Neighbor – Joining (NJ), (2) phương pháp Minimum Evolution, (3) phương pháp Maximum Parsimony và (4) phương pháp UPGMA, trong đó Neighbor - Joining là phương pháp thường được sử dụng nhất. Khoảng cách di truyền giữa các loài cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây. được xây dựng theo phương pháp NJ (Neighbor Joining) [32].
Dữ liệu DNA sau khi thực hiện ghép nối, xắp xếp thẳng hàng (alignment) để lập cây tiến hoá bằng phần mềm MEGA 4.0, sử dụng phương pháp Neighbor - Joining (NJ) với các thông số phân tích như sau:
- Kiểm tra phân tích: kiểm tra bằng giá trị bootstrap với số lần lặp lại (replicate) là 1000 lần.
- Dữ liệu thiếu/ khoảng trống nucleotide (do đột biến thêm bớt tạo ra): được xoá bỏ theo cặp (pairwise deletion).
- Mô hình đột biến: mô hình Maximum composite Likelihood với số lượng đột biến được tính bao gồm cả đột biến hoán đổi (A↔T, G↔C) và hoán vị (A↔C, A ↔ G, T ↔ C, T↔ G).