CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.4. Kết quả phân tích đa dạng nucleotide của 8 loài tre chƣa có tên khoa học
3.4.1. năm vùng gen nghiên cứu
3.4.1.1. Kết quả xác định trình tự vùng gen PIF
Trình tự vùng gen PIF thu được có độ dài là 442 bp đối với loài 8 loài: Mét ba vì (MBV), Bạc mày (BM), Mạy cượp (MC), Mạy khô (MK), Tre đông khê (TĐK), Tre lục bình (TLB), Tre không gai tân an (TKGTA) và Tre trãi long an (TTLA). Kết quả thống kê ở hình 3.12 đã chỉ ra 6 vị trí (35, 256, 404, 412, 416 và 432) đột biến bởi sự thay thế các nucleotide khi so sánh 8 loài tre nghiên cứu. Chẳng hạn, tại vị trí 404 và 416 khi so sánh
loài Tre không gai tân an với 07 loài tre còn lại thì (CA) được thay bằng (GG so sánh với 6 loài còn lại là (C) được thay bằng (T).
Vị trí 10 35 256 404 412 416 432 K3004/1 (BM) GTGGGGGCTT ***T***A** *G***C***G ***C******
K3004/2 ... ... ... ...
K3004/5 ... ... ... ...
K3007/1 (MBV) ... ... ... ...
K3007/2 ... ... ... ...
K3007/5 ... ... ... ...
K3009/1 (MC) ... ... ... ...G...
K3009/2 ... ... ... ...G...
K3009/5 ... ... ... ...G...
K3010/5 (MK) ... ... ... ...
K3010/8 ... ... ... ...
K3010/9 ... ... ... ...
K3012/3 (TĐK) ... ...C... ...G.... ...
K3012/5 ... ...C... ...G.... ...
K3012/6 ... ...C... ...G.... ...
K3013/2 (TLB) ... ...C...T.. ... ...
K3013/5 ... ...C...T.. ... ...
K3013/6 ... ...C...T.. ... ...
K3014/2 (TKGTA) ... ... .C...A ...
K3014/5 ... ... .C...A ...
K3014/8 ... ... .C...A ...
K3015/1 (TTLA) ... ... ... ...
K3015/2 ... ... ... ...
K3015/4 ... ... ... ...
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen PIF xác định từ 24 mẫu nghiên cứu thuộc 8 loài tre chưa xác định tên khoa học (K3004/1, K3004/2, K3004/5: Bạc mày;
K3007/1, K3007/2, K3007/5: Mét ba vì; K3009/1, K3009/2, K3009/5: Mạy cượp; K3010/5, K3010/8, K3010/9: Mạy khô; K3012/3, K3012/5, K3012/6: Tre đông khê; K3013/2, K3013/5, K3013/6: Tre lục bình; K3014/2, K3014/5, K3014/8: Tre không gai tân an;
K3015/1, K3015/2, K3015/4: Tre trãi long an)
3.4.1. A - trnH
Trình tự nucleotide vùng gen psbA - trnH thu được chiều dài 616 nucleotide đối với loài Bạc mày, 619 nucleotide đối với loài Mét ba vì và Mạy cượp, 620 nucleotide đối với loài Mạy khô, Tre không gai tân an và Tre trãi long an, 621 nucleotide đối với loài Tre đông khê, 615 nucleotide đối với loài Tre lục bình.
Vị trí 10 29 90 92 95 128 133 K3004/1 (BM) TTGAAGTTCC ***C***CTG GAA***---- -T***
K3004/2 ... ... ...---- -....
K3004/5 ... ... ...---- -....
K3007/1 (MBV) ... ...T.C C.G...GTTT --...
K3007/2 ... ...T.C C.G...GTTT --...
K3007/5 ... ...T.C C.G...GTTT --...
K3009/1 (MC) ... ...T.C C.G...GTTT --...
K3009/2 ... ...T.C C.G...GTTT --...
K3009/5 ... ...T.C C.G...GTTT --...
K3010/5 (MK) ... ...T.C C.G...GTTT T-...
K3010/8 ... ...T.C C.G...GTTT T-...
K3010/9 ... ...T.C C.G...GTTT T-...
K3012/3 (TĐK) ... ... ...GTTT T....
K3012/5 ... ... ...GTTT T....
K3012/6 ... ... ...GTTT T....
K3013/2 (TLB) ... ...T.C C.G...---- --...
K3013/5 ... ...T.C C.G...---- --...
K3013/6 ... ...T.C C.G...---- --...
K3014/2 (TKGTA) ... ...T...T.C C.G...GTTT T-...
K3014/5 ... ...T...T.C C.G...GTTT T-...
K3014/6 ... ...T...T.C C.G...GTTT T-...
K3015/1 (TTLA) ... ...T...T.C C.G...GTTT T-...
K3015/2 ... ...T...T.C C.G...GTTT T-...
K3015/4 ... ...T...T.C C.G...GTTT T-...
Hình 3.13. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen psbA-trnH xác định từ 24 mẫu nghiên cứu thuộc 8 loài tre chưa xác định tên khoa học (Ký hiệu mẫu của các loài như trong hình 3.12)
Sự khác nhau về trình tự nucleotide khi so sánh giữa tám loài tre nghiên cứu đã chỉ ra 11 vị trí (29, 90, 92, 93, 95, 128, 129, 130, 131 132 và 133
đi nucleotid 3.13. Ví dụ,
6 lo .
3.4.1.
Vị trí 10 267 404 503 565 869 1150 1362 K3004/1 (BM) CTTCCTCTTT ***C***C** *C***GCA** **T***C*** T*********
K3004/2 ... ... ... ... ...
K3004/5 ... ... ... ... ...
K3007/1 (MBV) ... ...A...A.. ... ..C...T... ...
K3007/2 ... ...A...A.. ... ..C...T... ...
K3007/5 ... ...A...A.. ... ..C...T... ...
K3009/1 (MC) ... ...A...A.. ... ..C...T... A...
K3009/2 ... ...A...A.. ... ..C...T... A...
K3009/5 ... ...A...A.. ... ..C...T... A...
K3010/5 (MK) ... ...A... ... ... ...
K3010/8 ... ...A... ... ... ...
K3010/9 ... ...A... ... ... ...
K3012/3 (TĐK) ... ... ... ... ...
K3012/5 ... ... ... ... ...
K3012/6 ... ... ... ... ...
K3013/2 (TLB) ... ...A...A.. ... ...T... ...
K3013/5 ... ...A...A.. ... ...T... ...
K3013/6 ... ...A...A.. ... ...T... ...
K3014/2 (TKGTA) ... ...A...A.. .T...AGC.. ... ...
K3014/5 ... ...A...A.. .T...AGC.. ... ...
K3014/8 ... ...A...A.. .T...AGC.. ... ...
K2015/1 (TTLA) ... ...A...A.. ... ...T... ...
K3015/2 ... ...A...A.. ... ...T... ...
K3015/4 ... ...A...A.. ... ...T... ...
Hình 3.14. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen matK xác định từ 24 mẫu nghiên cứu thuộc 8 loài chưa xác định tên khoa học (Ký hiệu mẫu của các loài như trong hình 3.12)
Trình tự mat
tre nghiên cứu. S 3.14
các nucleotide. Tại vị trí 267 (C) được thay thế bằng (A) khi so sánh hai loài Bạc mày và Tre đông khê với 6 loài tre còn lại.
(TAGC, tương ứng) được thay thế bằng (CGCA, tương ứng) khi so sánh với 7 loài tre nghiên cứu còn lại.
3.4.1. L-trnF
Trình tự vùng gen trnL-trnF có độ dài 936 nucleotide đối với loài Bạc mày, Tre đông khê và Tre trãi long an, 937 nucleotide đối với loài Mét ba vì, Mạy cư
5 vị trí đột biến chèn vào hay mất đi nucleotide ở các vị trí 310, 791, 824, 825 và 826 (hình 3.15). So sánh sự s
(A) bằng (G).
Tại vị trí 825 và 826 loài Tre không gai tân an đã xuất hiện thêm 2 nucleotide mới (CC, tương ứng) khi so sánh với 7 loài tre nghiên cứu còn lại.
Vị trí 10 310 791 824 826 K3004/1 (BM) AACCTGCTAA ***A***G** *---******
K3004/2 ... ... .---...
K3004/5 ... ... .---...
K3007/1 (MBV) ... ...G...A.. .C--...
K3007/2 ... ...G...A.. .C--...
K3007/5 ... ...G...A.. .C--...
K3009/1 (MC) ... ...G...A.. .C--...
K3009/2 ... ...G...A.. .C--...
K3009/5 ... ...G...A.. .C--...
K3010/5 (MK) ... ...G... .---...
K3010/8 ... ...G... .---...
K3010/9 ... ...G... .---...
K3012/3 (TĐK) ... ...G... .---...
K3012/5 ... ...G... .---...
K3012/6 ... ...G... .---...
K3013/2 (TLB) ... ...G...A.. .C--...
K3013/5 ... ...G...A.. .C--...
K3013/6 ... ...G...A.. .C--...
K3014/2 (TKGTA) ... ...G...A.. .CCC...
K3014/5 ... ...G...A.. .CCC...
K3014/8 ... ...G...A.. .CCC...
K3015/1 (TTLA) ... ...G... .---...
K3015/2 ... ...G... .---...
K3015/4 ... ...G... .---...
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen trnL-trnF xác định từ 24 mẫu nghiên cứu thuộc 8 loài chưa xác định tên khoa học (Ký hiệu mẫu của các loài như trong hình 3.12)
3.4.1. 2
Để có thêm cơ sở khoa học góp phần xác định tên khoa học (Bambusa sp.) cho tám loài tre
trãi long an, thì ngoài việc giải mã bốn vùng gen trên đây chúng tôi còn
giải mã thêm 01 v rpoC2.
rpoC2 có độ dài 479 nucleotide đối với loài Bạc mày, Mét ba vì, Mạy khô, Mạy cư
rpoC2 đã chỉ ra 26 vị trí đột biến chèn vào hay mất đi nucleotide (hình 3.16). Tuy nhiên đối với vùng gen này, khi so sánh trình tự nucleotide của 8 loài tre nghiên cứu thì duy nhất chỉ có loài Tre không gai tân an đã xuất hiện thêm 21 nucleotide mới (CCTAGAGGACGAATATAGGAC) tại các vị trí từ 92 đến 112. Đây là minh chứng khoa học cho phép nhận định Tre không gai tân an là loài loài tre mới của Việt Nam.
Vị trí 10 20 92 112 156 336 K3004/1 (BM) ACAGAAAAGA ***G***--- --- ---** *GG***G***
K3004/2 ... ...--- --- ---.. ...
K3004/5 ... ...--- --- ---.. ...
K3007/1 (MBV) ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3007/2 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3007/5 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3009/1 (MC) ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3009/2 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3009/5 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3010/5 (MK) ... ...T...--- --- ---.. .AA...A...
K3010/8 ... ...T...--- --- ---.. .AA...A...
K3010/9 ... ...T...--- --- ---.. .AA...A...
K3012/3 (TĐK) ... ...--- --- ---.. ...
K3012/5 ... ...--- --- ---.. ...
K3012/6 ... ...--- --- ---.. ...
K3013/2 (TLB) ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3013/5 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3013/6 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3014/2 (TKGTA) ... ...T...CCT AGAGGACGAA TATAGGAC.. ...A...
K3014/5 ... ...T...CCT AGAGGACGAA TATAGGAC.. ...A...
K3014/8 ... ...T...CCT AGAGGACGAA TATAGGAC.. ...A...
K3015/1 (TTLA) ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3015/2 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
K3015/4 ... ...T...--- --- ---.. ...A...
Hình 3.16. Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen rpoC2 xác định từ 24 mẫu nghiên cứu thuộc 8 loài chưa xác định tên khoa học (Ký hiệu mẫu của các loài như trong hình 3.12)
3.4.2.Mức độ đa dạng nucleotide của 08 loài tre nghiên cứu với 5 vùng gen
Trình tự nucleotide sau khi được xác định chính xác là các trình tự đích bằng chương trình Blast của ngân hàng gen NCBI (National Center of Biotechnology Information) được thực hiện sắp xếp (alignment) để phân tích so sánh và xác định các đặc điểm nucleotide đặc trưng cho loài. Bộ số liệu được alignment với các thông số ngẫu nhiên bởi chương trình ClustalW 1.6 trong phần mềm Bioedit. Kết quả alignment đã xác định được các nucleotide tương đồng và các nucleotide đa dạng. Trong quá trình alignment các khoảng trống “gap” sẽ được tạo ra. Đối với các loài có cùng tổ tiên,“gap” được coi là các đột biến thêm hoặc mất nucleotide và thể hiện bằng gạch ngang (-), các nucleotide giống nhau được thể hiện bằng dấu chấm (.).
, cụ thể
(1) Vùng gen PIF nhân có 436 vị trí bảo thủ (không biến đổi) và 6 vị trí biến đổi với 1 vị trí mang thông tin tiến hoá (parsimony);
(2) Vùng gen trnL-trnF có 935 vị trí bảo thủ và 2 vị trí cùng mang thông tin biến đổi và 1 vị trí mang thông tin tiến hóa;
(3) Vùng gen matK có 1528 vị trí bảo thủ và 9 vị trí cùng mang thông tin biến đổi với 4 vị trí mang thông tin tiến hóa;
(4) Vùng đệm gen psbA - trnH có 615 vị trí bảo thủ, 5 vị trí cùng mang thông tin biến đổi và tiến hóa.
(5) Vùng gen rpoC2 có 492 vị trí bảo thủ, 5 vị trí cùng mang thông tin biến đổi và tiến hóa
Mức độ đa dạng nucleotide trung bình khi so sánh giữa 08 loài với 5 vùng gen nghiên cứu cho thấy vùng gen PIF và rpoC2 có mức độ đa dạng nucleotide cao nhất (0,004%) và thấp nhất là vùng gen trnL-trnF và psbA-trnH (0,001%) (bảng 3.7). Kết quả còn cho thấy tính bảo thủ tương đối cao trong hệ gen lục lạp của 8 loài nghiên cứu. Theo nghiên cứu mới đây nhất của Zhang và cộng sự (2011), sự khác nhau về di truyền giữa các vùng gen lục lạp của phân họ Bambusoideae là rất thấp, trung bình 0,009%, trong đó chi Bambuseae chỉ là 0,003% [46].
Trong phân tích tiến hoá phân tử, mỗi vị trí trong một trình tự DNA hoặc amino acid được gọi là một đặc điểm (character) và sự thay đổi nucleotide hay amino acid tại các vị trí đó được gọi là sự biến đổi đặc điểm. Các nucleotide đa hình (polymorphirm) hầu hết là các nucleotide mang thông tin tiến hoá và được gọi là các vị trí parsimony. Lý thuyết tiến hoá phân tử coi các loài lúc đầu chỉ là một loài (chúng có trình tự nucleotide giống nhau), trong quá trình tiến hoá (do đột biến) hình thành nên các loài con cháu mang các trình tự nucleotide khác nhau. Quá trình tiến hoá chính là quá trình tích luỹ các đột biến nucleotide bên trong phân tử DNA. Dựa trên các phân tử DNA ty thể, DNA lục lạp mà các nhà khoa học tin rằng các đột biến tiến hoá theo quá trình hình thành loài nên có giá trị trong nghiên cứu phân loại. Như vậy, trong nghiên cứu này, tất cả các trình tự
nucleotide mang trong bộ gen của 8 loài nghiên cứu huộc chi Bambusa đều do một trình tự tổ tiên ban đầu đột biến thành.
Bảng 3.7. Thống kê mức độ biến đổi nucleotide khi so sánh giữa 8 loài nghiên cứu phân tích với 5 vùng gen
DNA nhân DNA lục lạp
PIF trnL-trnF psbA-trnH matK rpoC2 Vị trí bảo thủ 436/442 935/939 615/621 1528/1537 492/500
Vị trí biến đổi 6/442 2/939 5/621 9/1537 5/500
Vị trí mang thông tin
tiến hóa 1/442 1/939 5/621 4/1537 5/500
Vị trí singleton 5/442 1/939 0/621 5/1537 0/500
Mức độ đa dạng
nucleotide trung bình 0,004 0,001 0,001 0,002 0,004
Mức độ biến đổi nucleotide giữa các mẫu trong cùng loài nghiên cứu (3 mẫu/1 loài) phân tích ở cả năm vùng gen PIF, trnL-trnF, psbA-trnH, matK và rpoC2 cho thấy cả ba mẫu trong cùng một loài đều giống nhau 100% về trình tự DNA (không phát hiện được một nucleotide biến đổi nào xảy ra giữa các mẫu trong cùng loài). Vì vậy, trong nghiên cứu này, mỗi loài lấy đại diện 1 mẫu để phân tích, đánh giá mức độ đa dạng nucleotide giữa các loài nghiên cứu với nhau. Kết quả cho thấy, mức độ đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre nghiên cứu dao động từ 0,000 đến 0,002% đối với vùng gen trnL-trnF; từ 0,000 đến 0,003% đối với vùng gen psbA-trnH; từ 0,000 đến 0,005% đối với vùng gen matK; từ 0,000 đến 0,009% đối với vùng gen PIF (Bảng 3.9) và từ 0,000 đến 0,011 đối với vùng gen rpoC2 (Bảng 3.8). Sở dĩ có mức độ đa dạng nucleotide từ 0,000% là vì, khi phân tích xử lý trình tự nucleotide đã giải mã của 8 loài nghiên cứu trong phần mền MEGA 4.0 thì sự xuất hiện hay không xuất hiện các nucleotide đã bị bỏ qua. Nhưng thực tế, khi so sánh trình tự nucleotide giữa 8 loài thì đã có sự khác biệt. Trong 8 loài nghiên cứu phân tích với 5 vùng gen, loài tre Tân An cho mức độ đa dạng nucleotide cao nhất so với 7 loài còn lại từ 0,000 đến 0,002 % đối với vùng gen trnL-trnF; từ 0,001 đến 0,003 % đối với vùng
gen psbA-trnH; từ 0,003 đến 0,005 % đối với vùng gen matK; từ 0,005 đến 0,009 % đối với vùng gen PIF (bảng 3.9) và từ 0,000 đến 0,006% đối với vùng gen rpoC2.
Bảng 3.8. Mức độ đa dạng nucleotide của 8 loài nghiên cứu phân tích với vùng gen rpoC2
TT Tên mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8
1 K3004/1*
2 K3007/1 0.004
3 K3009/1 0.004 0.000
4 K3010/5 0.011 0.006 0.006
5 K3012/3 0.000 0.004 0.004 0.011 6 K3013/2 0.004 0.000 0.000 0.006 0.004 7 K3014/2 0.004 0.000 0.000 0.006 0.004 0.000 8 K3015/1 0.004 0.000 0.000 0.006 0.004 0.000 0.000
* Ghi chú: K3004/1: Bạc mày; K3007/1: Mét ba vì: K3009/1: Mạy cượp: K3010/5: Mạy khô; K3012/3: Tre đông khê; K3013/2: Tre lục bình; K3014/2: Tre không gai tân an;
K3015/1: Tre trãi long an.
Bảng 3.9. Mức độ đa dạng nucleotide của 8 loài tre nghiên cứu phân tích với bốn vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK và PIF
Vùng gen trnL-trnF Vùng gen psbA-trnH
TT Tên
mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
1 K3004/1
2 K3007/1 0.002 0.002
3 K3009/1 0.002 0.000 0.002 0.000
4 K3010/5 0.001 0.001 0.001 0.002 0.000 0.000
5 K3012/3 0.001 0.001 0.001 0.000 0.000 0.002 0.002 0.002 6 K3013/2 0.002 0.000 0.000 0.001 0.001 0.002 0.000 0.000 0.000 0.002 7 K3014/2 0.002 0.000 0.000 0.001 0.001 0.000 0.003 0.001 0.001 0.001 0.003 0.001 8 K3015/1 0.001 0.001 0.001 0.000 0.000 0.001 0.001 0.003 0.001 0.001 0.001 0.003 0.001 0.000
Vùng gen matK Vùng gen PIF
TT Tên mẫu
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
1 K3004/1
2 K3007/1 0.003 0.000
3 K3009/1 0.003 0.001 0.002 0.002
4 K3010/5 0.001 0.002 0.003 0.000 0.000 0.002
5 K3012/3 0.000 0.003 0.003 0.001 0.005 0.005 0.007 0.005 6 K3013/2 0.002 0.001 0.001 0.001 0.002 0.005 0.005 0.007 0.005 0.005 7 K3014/2 0.004 0.004 0.005 0.003 0.004 0.003 0.005 0.005 0.007 0.005 0.009 0.009 8 K3015/1 0.002 0.001 0.001 0.001 0.002 0.000 0.003 0.000 0.000 0.002 0.000 0.005 0.005 0.005
3.4.3. Mức độ đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre nghiên cứu với các loài thuộc chi Bambusa trên ngân hàng Genbank
Trong nghiên cứu này, trình tự nucleotide của 8 loài tre chưa có tên khoa học
Bambusa trnL-trn
psbA-trnH, 13 loài đối với vùng gen matK, 01 loài đối với vùng gen rpoC2 và 03 loài đối với vùng gen PIF) đã công bố trình tự nucleotide trên ngân hàng Genbank. Vì không có sự thay đổi trình tự giữa các mẫu trong cùng một loài (3mẫu/1loài) phân tích ở cả năm vùng gen nên mỗi loài chỉ lấy một mẫu đại diện để đánh giá mức độ đa dạng nucleotide. Kết quả cho thấy, mức độ đa dạng nucleotide giữa 8 loài nghiên cứu với các loài khác thuộc chi Bambusa trên Genbank dao động từ 0,000 đến 0,011%; từ 0,000 đến 0,003 %; từ 0,000 đến 0,005 %; 0,000 đến 0,005 % và từ 0,000 đến 0,571 % và tương ứng với 5 vùng gen rpoC2 (Bảng 3.10); psbA-trnH (Bảng 3.11); trnL-trnF (Bảng 3.12); matK (Bảng 3.13) và PIF (Bảng 3.14), tương ứng.
Bảng 3.10. Đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre nghiên cứu với 01 loài thuộc chi Bambusa trên Genbank phân tích ở vùng gen rpoC2
TT Tên mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 K3004/1
2 K3007/1 0.004
3 K3009/1 0.004 0.000
4 K3010/5 0.011 0.006 0.006
5 K3012/3 0.000 0.004 0.004 0.011 6 K3013/2 0.004 0.000 0.000 0.006 0.004 7 K3014/2 0.004 0.000 0.000 0.006 0.004 0.000 8 K3015/1 0.004 0.000 0.000 0.006 0.004 0.000 0.000 9 B. vulgaris 0.011 0.006 0.006 0.000 0.011 0.006 0.006 0.006
* Ghi chú: K3004/1: Bạc mày; K3007/1: Mét ba vì: K3009/1: Mạy cượp: K3010/5:
Mạy khô; K3012/3: Tre đông khê; K3013/2: Tre lục bình; K3014/2: Tre không gai tân an; K3015/1: Tre trãi long an.
Bảng 3.11. Đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre nghiên cứu với 22 loài thuộc chi Bambusa trên Genbank phân tích ở vùng gen psbA-trnH
TT Tên mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
1 K3004/1
2 K3007/1 0.003
3 K3009/1 0.003 0.000
4 K3010/5 0.003 0.000 0.000
5 K3012/3 0.000 0.003 0.003 0.003
6 K3013/2 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003
7 K3014/2 0.003 0.001 0.001 0.001 0.003 0.001
8 K3015/1 0.003 0.001 0.001 0.001 0.003 0.001 0.000
9 B. menbranacea 0.000 0.003 0.003 0.003 0.000 0.003 0.003 0.003
10 B. intermedia 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003
11 B. chungii 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000
12 B. grandis 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000
13 B. vulgaris 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000
14 B. yunnanensis 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000
15 B. surrecta 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
16 B. cerosissima 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
17 B. oldhamii 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
18 B. beecheyana 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
19 B. multiplex 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 20 B. pervariabilis 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 21 B. tuldoides 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 22 B. remotiflora 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 23 B. distegia 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 24 B. textilis 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 25 B. polymorpha 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 26 B. sinospinosa 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 27 B. blummeana 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 28 B. bambos 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 29 B. ventricosa 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 30 B. cornigera 0.003 0.000 0.000 0.000 0.003 0.000 0.001 0.001 0.003 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
* Ghi chú: K3004/1: Bạc mày; K3007/1: Mét ba vì: K3009/1: Mạy cượp: K3010/5: Mạy khô; K3012/3: Tre đông khê; K3013/2: Tre lục bình; K3014/2: Tre không gai tân an; K3015/1: Tre trãi long an.
Bảng 3.12. Đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre nghiên cứu với 14 loài thuộc chi Bambusa trên Genbank phân tích ở vùng gen trnL-trnF
TT Tên mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1 K3004/1
2 K3007/1 0.001
3 K3009/1 0.001 0.000
4 K3010/5 0.001 0.000 0.000
5 K3012/3 0.001 0.000 0.000 0.000
6 K3013/2 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000
7 K3014/2 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
8 K3015/1 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
9 B. membranavea 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
10 B. tulda 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
11 B. oliveriana 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
12 B. oldhamii 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
13 B.malingensis 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
14 B. beecheyana 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
15 B. bambos 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
16 B. chungii 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 17 B. surrecta 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 18 B. sinospinosa 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 19 B. intermadia 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 20 B. multiplex 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 21 B. blumeana 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 0.000 22 B. vulgaris 0.005 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.005 0.005 0.004 0.004
* Ghi chú: K3004/1: Bạc mày; K3007/1: Mét ba vì: K3009/1: Mạy cượp: K3010/5: Mạy khô; K3012/3: Tre đông khê; K3013/2: Tre lục bình; K3014/2: Tre không gai tân an; K3015/1: Tre trãi long an.
Bảng 3.13. Đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre nghiên cứu với 13 loài thuộc chi Bambusa trên Genbank phân tích ở vùng gen matK
TT Tên mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
1 K3004/1
2 K3007/1 0.003
3 K3009/1 0.003 0.001
4 K3010/5 0.001 0.002 0.003
5 K3012/3 0.000 0.003 0.003 0.001
6 K3013/2 0.002 0.001 0.001 0.001 0.002
7 K3014/2 0.004 0.004 0.005 0.003 0.004 0.003
8 K3015/1 0.002 0.001 0.001 0.001 0.002 0.000 0.003
9 B. tuldoides 0.003 0.001 0.002 0.002 0.003 0.001 0.004 0.001
10 B. dolichomerithalla 0.003 0.001 0.002 0.002 0.003 0.001 0.004 0.001 0.000
11 B. emeiensis 0.003 0.001 0.002 0.002 0.003 0.001 0.004 0.001 0.000 0.000
12 B. pachinensis 0.003 0.001 0.002 0.002 0.003 0.001 0.004 0.001 0.000 0.000 0.000
13 B. chungii 0.003 0.002 0.003 0.003 0.003 0.001 0.005 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
14 B. multiplex 0.003 0.001 0.001 0.003 0.003 0.001 0.005 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
15 B. membranacea 0.000 0.003 0.003 0.001 0.000 0.002 0.004 0.002 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 16 B. tulda 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001 0.001 0.004 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.002 0.002 0.001 17 B. oldhamii 0.003 0.001 0.002 0.002 0.003 0.001 0.004 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 0.003 0.001 18 B. beecheyana 0.003 0.002 0.003 0.003 0.003 0.001 0.005 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.000 0.001 0.003 0.002 0.001 19 B. oliveriana 0.001 0.003 0.004 0.001 0.001 0.003 0.005 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 0.004 0.004 0.001 0.002 0.003 0.004 20 B. malingensis 0.003 0.001 0.002 0.002 0.003 0.001 0.004 0.004 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001 0.001 0.003 0.001 0.000 0.001 0.003 21 B. bambos 0.001 0.001 0.002 0.001 0.001 0.001 0.004 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.002 0.002 0.001 0.000 0.001 0.002 0.002 0.001
* Ghi chú: K3004/1: Bạc mày; K3007/1: Mét ba vì: K3009/1: Mạy cượp: K3010/5: Mạy khô; K3012/3: Tre đông khê; K3013/2: Tre lục bình; K3014/2: Tre không gai tân an; K3015/1: Tre trãi long an.
Bảng 3.14. Đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre nghiên cứu với 3 loài thuộc chi Bambusa trên Genbank phân tích ở vùng gen PIF
TT Tên mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 K3004/1
2 K3007/1 0.000
3 K3009/1 0.002 0.002
4 K3010/5 0.000 0.000 0.002
5 K3012/3 0.005 0.005 0.007 0.005
6 K3013/2 0.005 0.005 0.007 0.005 0.005
7 K3014/2 0.005 0.005 0.007 0.005 0.009 0.009
8 K3015/1 0.000 0.000 0.002 0.000 0.005 0.005 0.005
9 B. bambos 0.182 0.182 0.179 0.182 0.176 0.176 0.188 0.182 10 B. chungii 0.191 0.191 0.188 0.191 0.185 0.185 0.194 0.191 0.195 11 B. multiplex 0.455 0.455 0.450 0.455 0.463 0.463 0.451 0.455 0.479 0.571
* Ghi chú: K3004/1: Bạc mày; K3007/1: Mét ba vì: K3009/1: Mạy cượp: K3010/5:
Mạy khô; K3012/3: Tre đông khê; K3013/2: Tre lục bình; K3014/2: Tre không gai tân an; K3015/1: Tre trãi long an.
Vị trí phân loại của 8 loài tre nghiên cứu trên cơ sở tổ hợp 5 vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF
Dữ liệu DNA sau khi thực hiện ghép nối, sắp xếp thẳng hàng (alignment) được tạo cây tiến hoá bằng phần mềm MEGA 4.0, sử dụng phương pháp Neighbor-Joining (NJ) với các thông số phân tích: (1) Kiểm tra phân tích bằng giá trị bootstrap với số lần lặp lại (replicate) là 1000 lần; (2) Dữ liệu thiếu/ khoảng trống nucleotide (do đột biến thêm bớt tạo ra) đều được xoá bỏ theo cặp (pairwise deletion); (3) Mô hình đột biến:
mô hình Maximum composite Likelihood với số lượng đột biến được tính bao gồm cả đột biến hoán đổi (A↔T, G↔C) và hoán vị (A↔C, A ↔ G, T ↔ C, T↔ G). Khoảng cách di truyền giữa các loài cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây.
Kết quả phân tích vị trí phân loại của 8 loài tre phân tích với 5 vùng gen được trình bày trong hình 3.17 cho thấy tất cả 8 loài tre đều hình thành một nhánh tiến hóa riêng và liên quan mật thiết với nhau. Các giá trị bootstrap thu được tại điểm nút tạo nhánh của mỗi loài dao động từ 43 đến 99%. Mối quan hệ gần gũi nhất được chỉ ra trên cây tiến hoá là giữa loài Mét ba vì (K3007/1) và loài Mạy cượp (K3009/1) và giữa
loài Bạc mày (K3004/1) và loài Tre đông khê (K3012/3). Trong số 8 loài nghiên cứu thì loài Tre không gai tân an (K3014/2) có khoảng cách di truyền xa nhất so với 7 loài còn lại.
Hình 3.17. Vị trí phân loại của 8 loài tre chưa có tên khoa học của Việt Nam bằng
phần mềm MEG -
gen trnL-trnF; psbA-trnH; matK; rpoC2 và PIF
* Ghi chú: K3004/1 (BM): Bạc mày; K3007/1 (MBV): Mét ba vì: K3009/1 (MC): Mạy cượp: K3010/5 (MK): Mạy khô; K3012/3 (TDK): Tre đông khê; K3013/2 (TLB): Tre lục bình; K3014/2 (TKGTA): Tre không gai tân an; K3015/1 (TTLA): Tre trãi long an.
Vị trí phân loại của 8 loài tre nghiên cứu với các loài tre đã có trên ngân hàng Genbank
Vị trí phân loại của 8 loài tre nghiên cứu với các loài tre đã có trên ngân hàng Genbank đối với 5 vùng gen đã phân tích được thể hiện trong hình 3.18 cho thấy (14 loài thuộc chi Bambusa trnL-trnF (hình 3.18A), 13 loài thuộc chi Bambusa phân tích với vùng gen matK (hình 3.18 Bambusa p psbA-trnH (hình 3.18C), 01 loài B. vulgaris phân tích với vùng gen rpoC2 (hình 3.18D) và 3 loài thuộc chi Bambusa phân tích với vùng gen PIF (hình 3.18E)) giữa 08 loài nghiên cứu cũng có sự khác biệt với các loài đã công bố trình tự trên ngân hàng Genbank.
K3007/1 (MBV)
K3009/1 (MC) K3013/2 (TLB)
K3014/2 (TKGTA) K3015/1 (TTLA)
K3010/5 (MK)
K3004/1 (BM) K3012/3 (TDK)
99 88
65
43 85
0.0002
Hình 3.18.
- Bambusa
trnL-trnF; matK; psbA-trnH; rpoC2 và PIF ((Các trình tự được sử dụng để so sánh vùng gen trnL-trnF có mã hiệu: B.
menbranacea (EU434060); B. tulda (EU434056); B. oliveriana (EU434055); B.
oldhamii (EU434054); B. malingensis (EU434053); B. beecheyana (EU434052); B.
bambos (EU434051); B. chungii (HM448964); B. surrecta (DQ137351); B.
sinospinosa (DQ137350); B. intermedia (DQ137348); B. multiplex (DQ137345); B.
blumeana (DQ137346); B. vulgaris (EF137524)); ((Các trình tự được sử dụng để so sánh vùng gen psbA-trnH có mã hiệu: B. membranacea (GU063119); B. intermedia
B. bambos B chungii B. sinospinosa K3013/2 (TLB)
K3007/1 (MBV) K3015/1 (TTLA) K3014/2 (TKGTA) B. malingensis
K3004/1 (BM) B oldhamiiB blumeana B. tulda
K3010/5 (MK) B. surrecta K3009/1 (MC)
B. intermedia B. oliveriana
K3012/3 (TDK) B. multiplex B. membranacea B. beecheyana B. blumeana B. chungii
B. vulgaris 0.0005
B. chungii B. beecheyana B. dolichomerithalla B. malingensis B. emeiensis B. tuldoides B. oldhamii B. pachinensis
B. multiplex K3007/1 (MBV)
K3009/1 (MC) K3015/1 (TTLA)
K3013/2 (TLB) B. tulda B. bambos K3010/5 (MK)
K3012/3 (TDK) K3004/1 (BM) B. membranacea
B. oliveriana
K3014/2 (TKGTA) 68
50
64
44
56 44
55 46
45 44
0.0005
K3014/2 (TKGTA) K3015/1 (TTLA) B. cerosissima
B. surrecta B. grandis K3007/1 (MBV) K3010/5 (MK) K3009/1 (MC) B. yunnanensis B. intermedia B. tuldoides B. pervariabilis B. sinospinosa B. cornigera B. oldhamii B. beecheyana B. polymorpha B. textilis K3013/2 (TLB) B. ventricosa B. remotiflora B. multiplex B. blumeana B. distegia B. bambos B. vulgaris B. chungii
K3012/3 (TDK) K3004/1 (BM) B. membranacea 98
64
0.0002
K3004/1 (BM) K3012/3 (TDK) K3013/2 (TLB)
K3015/1 (TTLA) K3014/2 (TKGTA) K3009/1 (MC) K3007/1 (MBV)
K3010/5 (MK) B. vulgaris 96 88 20
20 8 10
0.001
K3004/1 (BM) K3015/1 (TTLA) K3007/1 (MBV) K3010/5 (MK)
K3012/3 (TDK) K3013/2 (TLB) K3014/2 (TKGTA) K3009/1 (MC)
B. bambos B. chungii B. multiplex 90
9759 49
41 49
0.05
trnL-trnF matK
psbA-trnH
rpoC2
PIF
(GU063100); B. chungii (GU063099); B. grandis (GU063098); B. vulgaris (GU063097); B. yunnanensis (GU063095); B. surrecta (GU063094); B. cerosissima (GU063093); B. oldhamii (GU063089); B. beecheyana (GU063088); B. multiplex (GU063085); B. pervariabilis (GU063084); B. tuldoides (GU063083); B. remotiflora (GU063082); B. sinospinosa (GU063077); B. bambos (GU063074); B. ventricosa (GU063074); B. distegia (GU063081); B. textilis (GU063079) B. polymorpha (GU063078); B. blumeana (GU063076); B. cornigera (GU063073)). ((Các trình tự được sử dụng để so sánh vùng gen matK có mã hiệu: B. tuldoides (HM448948); B.
dolichomenithalla (HM448935); B. emeiensis (HM448948); B. pachinensis (HM448936); B. chungii (HM448934); B. multiplex (EF125166); B. membranacea (EU434252); B. tulda (EU434246); B. oldhamii (EU434246); B. beecheyana (EU434244); B. oliveriana (EU434247); B. malingensis (EU434245); B. bambos (EU434243)); ((trình tự sử dụng để so sánh vùng gen rpoC2 có mã hiệu: B. vulgaris (U90824)); ((Các trình tự được sử dụng để so sánh vùng gen PIF có mã hiệu: B.
multiplex (DQ861457); B. bambos (DQ861455); B. chungii (DQ861456)).
5 vùng gen đối với tám loài tre cần xác định tên khoa học
- Đã xác định được trình tự nucleotide cho tất cả 24 mẫu thuộc 8 loài tre có độ dài 939 nucleotide, 621 nucleotide, 1537 nucleotide, 500 nucleotide và 442 bp đối với các vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF, tương ứng.
100% ở cả năm vùng gen trnL- trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF.
- Mức độ đa dạng nucleotide giữa 8 loài tre dao động từ 0,000 đến 0,002%; từ 0,000 đến 0,003%; từ 0,000 đến 0,005%; từ 0,000 đến 0,011% và từ 0,000 đến 0,009%
tương ứng với năm vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF.
- Loài Tre không gai tân an cho mức độ đa dạng nucleotide cao nhất ở cả năm vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF từ 0,000 đến 0,002%; từ 0,001 đến 0,003%; từ 0,003 đến 0,005%; từ 0,000 đến 0,006% và từ 0,005 đến 0,009%, tương ứng.
- Mức độ đa dạng nucleotide giữa 8 loài với các loài thuộc chi Bambusa trên Genbank dao động từ 0,000 đến 0,005%; từ 0,000 đến 0,003%; từ 0,000 đến 0,005%;
từ 0,000 đến 0,011% và từ 0,000 đến 0,571% tương ứng với 4 vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF.
- Duy nhất chỉ có Tre không gai tân an là giống với loài Tre long an ở vùng gen psbA-trnH và không giống với một loài tre nào trên ngân hàng Genbank ở cả 5 vùng gen