CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre nghiên cứu với các vùng gen đích
A B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
cầu hai (Bambusa (Lingnania (Bambusa (Lingnania) longissima)); Đối với 08 loài tre chưa xác định tên khoa học (Bambusa sp.) đó là Bạc mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông
Tre trãi long an thì ngoài việc giải mã bốn vùng gen trên chúng tôi còn giải mã thêm 01 vùng gen lục lạp (rpoC2).
3.2.1. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi PIF5/PIF3
Trình tự đoạn gen đích đã được nhân bản thành công với cặp mồi PIF5/PIF3 cho tất cả các mẫu nghiên cứu. Hình 3.2 là kết quả đại diện của 11 loài tre nghiên cứu (mỗi loài 1 mẫu), sản phẩm PCR chỉ xuất hiện duy nhất 01 băng có kích thước khoảng 450 bp.
Kết quả này cũng phù hợp với kích thước lý thuyết dự đoán. Do vậy, sản phẩm PCR tiếp tục được tinh sạch phục vụ cho việc giải mã trình tự nucleotide.
Hình 3.2. Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi PIF5/PIF3 điện di trên gel agarose 0,9%. (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)
3.2.2. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi psbA3’f/trnH
Vùng psbA – trnH đã được chứng minh là vùng dễ thực hiện phản ứng PCR nhất đối với rất nhiều loài thực vật [35]. Do có một vùng không mã hoá nên kích thước của vùng psbA - trnH cũng thay đổi khác nhau giữa các loài. Vùng này có kích thước biến đổi trong một giới hạn rất lớn, từ 247bp đến 1221bp [27]. Cặp mồi psbA3’f/trnH đã được sử dụng để nhân bản đoạn DNA cho tất cả 11 loài tre nghiên cứu. Kết quả cho thấy sản phẩm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
0.25 kb 0.5 kb
PCR trên gel agarose 0,9 % tại hình 3.3 cho thấy chỉ thu được một phân đoạn DNA có kích thước khoảng 680 bp (đúng như kích thước lý thuyết). Với kết quả
.
Hình 3.3. Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH điện di trên gel agarose 0,9%. (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)
3.2.3. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi matK19F/matKR
Hình 3.4. Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi matK19F/matKR điện di trên gel agarose 0,9%. (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)
Cặp mồi matK19F/matKR (thiết kế dựa trên trình tự đoạn gen đã công bố trên ngân hàng Genbank mã số HM448934) cũng đã nhân bản thành công đoạn gen matK cho tất cả 11 loài tre nghiên cứu (hình 3.4). Gen matK là một gen chức năng do vậy thường
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
0.5 kb 0.75 kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
1 kb 1.5 kb
không có các đột biến thêm bớt nucleotide xảy ra trên gen, nên kích thước giữa các loài tương đối ổn định. Gen matK có kích thước đầy đủ là 2450 bp, tuy nhiên trong nghiên cứu này cặp mồi được thiết kế chỉ nhân bản đoạn DNA có kích thước 1560 bp và nằm gần đầu 3’ của gen. Sản phẩm PCR nhận được ở đây có kích thước đúng như kích thước lý thuyết dự đoán.
3.2.4. Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi trnLF/trnFR
Kết quả trong hình 3.5 cho thấy, tất cả 11 loài tre đã nhân bản được 1 phân đoạn DNA đặc hiệu đúng với kích thước dự đoán (~ 1000 bp), đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu xác định trình tự DNA.
Hình 3.5. Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi trnLF/trnFR điện di trên gel agarose 0,9%. (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)
3.2.5. Kết quả nhân bản trình tự DNA 8 tre loài cần xác định tên khoa học với cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2
Để có thêm độ tin cậy trong việc đánh giá mức độ đa dạng nucleotide cho 8 loài chưa có tên khoa học, chúng tôi đã sử dụng thêm cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2 để nhân bản gen đích chỉ cho 24 mẫu thuộc 08 loài tre chưa xác định tên khoa học (Bambusa
. Kết quả phân tích sản phẩm PCR trong hình 3.6 cho thấy, đã
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0.75 kb 1 kb
nhân được 01 phân đoạn DNA đặc hiệu và đúng với kích thước dự đoán khoảng 600 bp, đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu xác định trình tự DNA.
Hình 3.6. Sản phẩm PCR đại diện của 08 loài tre phân tích với cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2 điện di trên gel agarose 0,9%. ((M: marker phân tử 1 kb, mỗi loài đại diện 01 mẫu, giếng 1: Bạc mày, 2: Mét ba vì, 3: Mạy cượp, 4: Mạy khô, 5: Tre đông khê, 6: Tre lục bình, 7: Tre không gai tân an, 8: Tre trãi long an)