1.3. Lên men axit lactic từ rơm rạ
1.3.3. Quá trình lên men sản xuất axit lactic từ xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ bằng vi khuẩn lactic
1.3.3.2. Chủng giống vi sinh vật
Axit lactic có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo bởi các loài vi sinh vật (VSV) khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm mốc, nấm men, vi tảo và vi khuẩn lam. Lựa chọn các chủng VSV là rất quan trọng, đặc biệt ảnh hưởng đến độ tinh khiết quang học của axit lactic và hiệu suất sản xuất axit lactic [8]. Ngoài ra, sử dụng tổ hợp các chủng VSV trong quá trình lên men lactic có thể tạo ra sự kết hợp của các con đường trao đổi chất và do đó nâng cao hiệu quả sản xuất axit lactic [30, 60, 76, 114].
Vi khuẩn sản xuất axit lactic bao gồm các chủng tự nhiên và chủng đột biến. Những sinh vật này có thể được chia thành 4 nhóm chính: Vi khuẩn lactic (LAB), các chủng của chi Bacillus, loài Escherichia coli và Corynebacterium glutamicum [8]. Tuy nhiên trong quá trình lên men ở qui mô công nghiệp, việc sử dụng các loài khác nhau của chi Lactobacillus được ưa thích vì khả năng chuyển hóa, năng suất và tốc độ trao đổi chất cao hơn [71].
a. Vi khuẩn lactic (LAB).
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn thường Gram dương, không di động, không tạo thành bào tử và không có hình thái cố định (bao gồm hình que và hình cầu) nhưng về mặt sinh lí chúng tương đối đồng nhất, bao gồm 20 chi trong đó có những chi chính như Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella và Streptococcus.
Trong đó, Lactobacillus là chi lớn nhất bao gồm 80 loài.
Vi khuẩn lactic thu nhận năng lượng nhờ phân giải carbohydrat và sinh ra axit lactic. Vi khuẩn lactic không chứa xitocrom và enzyme catalase, chúng là các vi khuẩn sống từ kị khí đến vi hiếu khí [132].
Vi khuẩn lactic có nhu cầu về các chất dinh dưỡng rất phức tạp bởi vì chúng không có nhiều khả năng tự sinh tổng hợp nên các chất dinh dưỡng. Nhu cầu về dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau là khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ. Vi khuẩn lactic thường có ở trong sữa và các sản phẩm từ sữa, trên bề mặt của xác thực vật đang phân giải, trong ruột và ở vài lớp màng nhầy của người và động vật. Lactobacillus, Leuconostoc có nhiều trong thực vật thối rữa như rau bị hỏng hoặc phân động vật,…[140].
LAB có điều kiện phát triển trong phạm vi pH 3,5-10,0 và nhiệt độ 5- 45°C [8]. Theo mô hình lên men và sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men, vi khuẩn lactic chia thành 2 loại: Vi khuẩn lên men đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình [116]. Vi khuẩn lên men đồng hình tạo ra sản phẩm cuối cùng là axit lactic chiếm hơn 85%, trong khi đó vi khuẩn lên men dị hình ngoài axit lactic chiếm khoảng 40%, còn tạo ra axit axetic, ethanol,
24
CO2,…Hầu hết LAB bao gồm cả chi Lactobacilli được xem là an toàn cho sức khỏe của người tiêu dùng và người sản xuất. Những chủng LAB công nghiệp quan trọng như các chi Lactobacillus đặc biệt hữu ích do chúng có khả năng chịu axit cao và khả năng sản xuất D- axit lactic hoặc L- axit lactic [17, 63, 64].
- Vi khuẩn lactic có khả năng lên men axit lactic từ xylose.
Xylose là thành phần chính của dịch thủy phân hemicellulose của lignocellulose từ phế thải nông nghiệp, là loại đường nhiều thứ hai tiếp sau glucose trong tự nhiên [86]. Tuy nhiên, xylose lại không có giá trị như là nguồn dinh dưỡng với nhiều loại vi sinh vật, do đó phần lớn vi sinh vật không thể lên men xylose [112]. Vì vậy, sử dụng hiệu quả nguồn đường xylose trong lên men sản xuất axit lactic cũng là một trong những phương pháp thúc đẩy việc sử dụng nguồn nguyên liệu lignocellulose trong đó có rơm rạ [84].
Đa số các chủng LAB có thể chuyển hóa đường glucose thành axit lactic nhưng không thể chuyển hóa đường pentose (xylose) thu được từ dịch thủy phân hemicellulose [7].
Phần lớn chủng LAB dị hình chuyển hoá đường pentose để tạo thành axit lactic và các sản phẩm phụ (axit axetic, etanol,...) qua con đường PK với lượng axit lactic lớn nhất là 0,6g trên 1g pentose [8].
Một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men lactic từ đường xylose cụ thể như bảng 1.2.
Bảng 1.2. Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose
Chủng vi khuẩn
Hiệu suất lên men axit lactic
(%)
Tài liệu tham khảo
L. xylosus 41 Tyree R.W. và cộng sự
(1990).
L. pentosus 56 Thomas S. và cộng sự
(2000).
Lactococcus lactis IO-1
(Lc. lactic IO-1) 46,9 Ishizaki A. và cộng sự
(2002).
Lactococcus lactis IO-1 (JCM 7638)
(Lc. lactic IO-1 (JCM 7638)) 68 Tanaka K. và cộng sự (2002).
L. casei subsp. rhamnous (ATCC 10.863) 80 Iyer P.V. và cộng sự (2000).
L. plantarum NCIMB 8826 đột biến
88 Okano K. và cộng sự (2009).
Lactococcus lactis IL 1403 đột biến
(Lc. lactis IL 1403 đột biến) 89 Shinkawa S. và cộng sự (2011).
Enterococcus mundtii QU25
(E. muntidi QU25) 79 Abdel- Rahman và cộng
sự (2011).
25
Nhìn chung, nhiều vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Lactococcus được công bố có khả năng lên men xylose [7, 44, 50, 55]. Tuy nhiên, những vi khuẩn phân lập từ tự nhiên hầu hết đều lên men dị hình, với năng suất lý thuyết của axit lactic 60% tính theo trọng lượng xylose được tiêu thụ [114] chẳng hạn như các chủng L. xylosus, L. pentosus, Lc. lactic IO-1, Lc. lactic IO-1(JCM 7638) (bảng 1.2), chỉ có chủng tự nhiên E. mundtii QU 25 và chủng đột biến L. plantarum NCIMB 8826; Lc. lactis IL 1403 có khả năng lên men axit lactic hiệu suất cao (bảng 1.2).
Xylose là thành phần chính của quá trình thủy phân hemicellulose của lignocellulose, một số chủng LAB có khả năng lên men từ dịch thủy phân hemicellulose của lignocellulose, cụ thể như:
L. bifermentans DSM 20003 có khả năng lên men dịch thủy phân cám lúa mì chứa xylose 50 ± 5 g/l; glucose 18 ± 3 g/l; arabinose 29 ± 5 g/l. Sau 54 giờ lên men, glucose, arabinose được tiêu thụ hết, xylose vẫn còn dư và hiệu suất lên men axit lactic đạt 83%
[39].
L. pentosus ATCC 8041 có khả năng lên men đường xylose thu được từ dịch thủy phân hemicellulose của chồi cây nho, dịch thủy phân thu được chủ yếu là đường xylose 17,5 g/l; 12 g/l glucose và một phần nhỏ đường arabinose 4,3 g/l, hiệu suất lên men axit lactic là 77% [23].
Sản xuất axit lactic từ chất thải rắn của nhà máy bột giấy sử dụng chủng L.
delbrueckii RRL B445 có khả năng lên men sản xuất axit lactic từ xylose. Thomass S. đã thu được hiệu suất lên men lactic đạt từ 88 - 92% [117].
Ngoài ra, để tăng hiệu suất lên men axit lactic từ dịch thủy phân hemicellulose của lignocellulose, một số tác giả đã kết hợp 2 chủng vi khuẩn với nhau, chẳng hạn như:
Arvid G. và cộng sự đã nghiên cứu sản xuất axit lactic từ dịch đường thu được từ quá trình thủy phân hemicellulose của rơm lúa mì bằng enzyme bởi hỗn hợp loài L.
pentosus và L. brevis. Hiệu suất lên men axit lactic từ dịch thủy phân lúa mì bởi L.
pentosus CHCC 2355 là 88%, bởi L. brevis CHCC 2097 là 51% và bởi hỗn hợp L.
pentosus và L. brevis là 95% [15].
- Vi khuẩn có khả năng tổng hợp axit lactic từ cellobiose.
Sinh khối cellulose là một nguồn sinh khối phong phú, có khả năng tái tạo, giá thành rẻ và có chứa một lượng đường đáng kể. Cellulose là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất axit lactic. Do đó, để tăng hiệu quả sử dụng nguồn nguyên liệu này đòi hỏi phải có các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng các loại đường chính thu được từ quá trình thủy phân cellulose đó là đường glucose và cellobiose [6].
26
Một số các nghiên cứu trong lên men axit lactic từ cellobiose bằng cách sử dụng chủng LAB bao gồm: L. delberueki mutant Uc -3; L. plantarum đột biến; L. lactis mutant RM 2-24. Nhưng tất cả các chủng này là đột biến hoặc tái tổ hợp chủng. Gần đây, Abbel - Rahman M.A. và cộng sự đã phân lập thành công chủng hoang dại E. mundtii QU 25 có khả năng lên men đồng hình đường cellobiose (Bảng 1.3).
Bảng 1.3. Một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ cellobiose
Chủng vi khuẩn Hiệu suất lên
men lactic (%) Tài liệu tham khảo E. mundtii QU25 94 Abbel - Rahman M.A. và
cộng sự (2011) L. delbrueckii mutant
Uc-3 90 Adsul M. và cộng sự
(2007) L. plantarum pCU /
ΔldhL1 79,18 Okano K. và cộng sự
(2010) L. plantarum PCU-
CelA/ ΔldhL1 82,57 Okano K. và cộng sự (2010)
L. lactis RM2-24 đột
biến 80 Singhvi M. và cộng sự
(2010)
Như vậy, ngoài chủng tự nhiên E. mundtii QU25 thì chỉ có các chủng đột biến mới lên men axit lactic từ cellobiose (Bảng 1.3). Vì vậy, phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có nguồn gốc tự nhiên có khả năng lên men axit lactic từ đường cellobiose là cần thiết.
- Vi khuẩn có khả năng tổng hợp axit lactic từ dịch thủy phân lignocellulose.
Kim J.H. và cộng sự đã nghiên cứu chuyển hóa rơm rạ thành axit lactic bởi chủng L. brevis, chủng này có khả năng sử dụng đường xylose và glucose. Sau 24 giờ lên men thu được 30,5 g/l axit lactic; 16,7 g/l axit axetic; 5,2 g/l ethanol, hiệu suất lên men axit lactic là 53,32% [59].
Guo W. và cộng sự đã chỉ ra rằng khi sử dụng dịch thủy phân cây ngô, L. brevis S3F4 tạo ra 39 g/l axit lactic từ một hỗn hợp chứa khoảng 57 g/l đường, đạt hiệu suất lên men axit lactic là 74%. Quan trọng hơn, L. brevis chuyển hóa đồng thời glucose và xylose và cho thấy không có sự ức chế tăng trưởng hoặc giảm sự hình thành sản phẩm trong sự hiện diện của 10 mM furfural và axit ferulic [41].
27
Trong dịch thủy phân của lignocellulose ngoài đường glucose còn có đường xylose, cellobiose và arabinose. Việc lựa chọn các chủng giữ một vai trò quan trọng cho việc chuyển đổi hiệu quả của hỗn hợp đường. Do đó, kết hợp các chủng vi khuẩn với nhau trong lên men axit lactic là cần thiết để nâng cao hiệu suất lên men. Dựa trên điều này, một hỗn hợp của L. rhamnosus (lên men đồng hình glucose) và L. brevis ATCC 367 (lên men dị hình xylose) đã được nghiên cứu để cải thiện khả năng sử dụng các loại đường thu được từ hemicellulose và cellulose từ cây ngô (trừ hạt ngô). Khi sử dụng hai chủng lên men đồng thời từ sẽ tạo ra hiệu suất lên men axit lactic là 70% cao hơn khi chỉ sử dụng chủng L.
rhamnosus (hiệu suất lên men axit lactic 59%) hoặc chủng L. brevis ATCC 367 (hiệu suất lên men axit lactic là 54%), ngoài ra sản phẩm axit lactic thu được từ quá trình lên men của 2 chủng là hỗn hợp D, L axit lactic [30].
Zhang Y. và cộng sự sử dụng kết hợp L. brevis ATCC 367 và L. plantarum ATCC 21028 trong quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân cây ngô đạt hiệu suất lên men axit lactic là 78% cao hơn khi chỉ sử dụng đơn chủng L. plantarum ATCC 21028 (hiệu suất lên men axit lactic đạt 50%) và chủng L. brevis ATCC 367 (hiệu suất lên men axit lactic đạt 39%). Sản phẩm axit lactic thu được từ quá trình lên men của kết hợp 2 chủng là hỗn hợp D,L axit lactic [142].
Sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân của thân cây đậu tương bởi L. sake và L.
casei. Hỗn hợp đường thu được từ quá trình thủy phân bao gồm glucose, xylose và cellobiose theo tỷ lệ 3,9: 1,7: 1. Quá trình lên men của dịch thủy phân này bởi từng loài L.
sake và L. casei tạo ra hiệu suất lên men axit lactic tương ứng là 48% và 56% nhưng hiệu suất lên men axit lactic tăng lên 71% khi sử dụng đồng thời cả hai loài L. sake và L. casei [145].
Nancib A. và cộng sự đã so sánh khả năng sản xuất axit lactic từ dịch quả chà là bằng các loài đơn hoặc hỗn hợp loài L. casei và L. lactis. Lên men axit lactic sử dụng hỗn hợp loài thì nồng độ axit lactic là 60,3 g/l, khi chỉ sử dụng L. lactis thì nồng độ axit lactic đạt được 42 g/l, nếu sử dụng L. casei thì nồng độ axit lactic đạt 53 g/l [76].
Tóm lại, để tăng hiệu quả sử dụng sinh khối lignocellulose nói chung và rơm rạ nói riêng trong sản xuất axit lactic đòi hỏi các loại đường chính thu được từ quá trình thủy phân lignocellulose (glucose, cellobiose, xylose,…) phải được sử dụng hiệu quả. Tuy nhiên, đa số LAB có khả năng lên men glucose nhưng LAB có khả năng lên men xylose và cellobiose chưa thực sự nhiều. Do đó, việc phân lập và tuyển chọn chủng LAB có khả năng lên men xylose, cellobiose là một hướng đi tích cực. Ngoài ra, sử dụng kết hợp chủng LAB
28
với nhau trong lên men axit lactic từ dịch thủy phân lignocellulose là cần thiết để nâng cao hiệu suất lên men lactic.
b. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic.
Để đảm bảo sự tồn tại và tăng trưởng, môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic phải đảm bảo đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết: Nguồn carbon, nguồn nitơ, chất khoáng và các vi tamin [96].
+ Nguồn dinh dưỡng carbon.
Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy có thể là các loại đường, axit amin và axit hữu [30]. Carbon rất quan trọng cho sự tăng trưởng của vi sinh vật hoặc lên men. Trong lên men axit lactic có thể sử dụng các nguồn carbon khác nhau: glucose, fructose, saccarose, xylose, cellobiose,...hoặc nguồn nguyên liệu có chứa đường như whey, rỉ đường, tinh bột,...[55]. Nguồn carbon được lựa chọn là quan trọng vì nó sẽ ảnh hưởng đến sản xuất axit lactic cũng như con đường chuyển hóa.
Trong những năm gần đây, lignocellulose được coi như là nguồn nguyên liệu cho lên men sản xuất axit lactic, điều này đã thúc đẩy việc sử dụng nguồn đường xylose, cellobiose có trong lignocellulose [69, 84]. L. xylosus và L. rhamnosus đã được sử dụng trong môi trường chứa hỗn hợp đường glucose, xylose và trong dịch thủy phân của gỗ [50, 122]. L. rhamnosus ATCC 7469 cũng có khả năng sử dụng cellobiose như là nguồn carbon trong lên men sản xuất axit lactic từ bùn giấy tái chế [68].
Các chi vi khuẩn có khả năng lên men dị hình đường pentose như Lactobacillus, Lactococcus, Enterococci và Pediococcus. Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn lactic lên men xylose và tốc độ tăng trưởng trong môi trường chứa xylose thấp hơn trong môi trường chứa glucose [112].
Các loài vi khuẩn lactic khác nhau có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau. L. debbrueckii có thể sử dụng đường maltose, glucose, galactose, saccarose, dextrin và không sử dụng lactose; L. brevis sử dụng được glucose, xylose nhưng không sử dụng được cellobiose, một số loài vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột,...
Mức độ ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật khác nhau tùy thuộc vào loại cơ chất, chẳng hạn glucose có thể ức chế ở nồng độ trên 200 g/l, nguyên nhân có thể là do giảm hoạt độ nước. Trong công nghiệp lên men, nồng độ đường trong môi trường ban đầu được điều chỉnh đến 5 - 20% [106].
+ Nguồn dinh dưỡng nitơ.
Lên men axit lactic thường sử dụng 2 nguồn nitơ đó là nitơ hữu cơ (peptone, cao nấm men) và các hợp chất vô cơ (urê hoặc ammonium sulfate) [77].
29
Loại và nồng độ các nguồn nitơ ảnh hưởng đến lên men axit lactic. Cao nấm men là nguồn nitơ thường được sử dụng nhất trong quá trình lên men axit lactic. Nồng độ axit lactic tăng đồng thời với việc tăng nồng độ của cao nấm men. Tốc độ tạo ra axit lactic cao nhất đã được tìm thấy khi bổ sung 5-15 g/l cao nấm men [40, 67]. Sử dụng cao nấm men tạo ra hiệu suất lên men axit lactic cao hơn so với các nguồn nitơ khác như malt, bột đậu nành, urê, tryptone, casein thủy phân,… [44, 67].
+ Nguồn dinh dưỡng vitamin.
Vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin, vì vậy cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy các vitamin. Các vitamin đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào ( một vai trò quan trọng không thể thay thế được). Các vi khuẩn lactic khác nhau thì nhu cầu dinh dưỡng vitamin cũng khác nhau. Các vitamin (chủ yếu thuộc nhóm B) có trong cao nấm men là nhân tố đóng vai trò quan trọng trong nhiều phản ứng enzyme và để kích thích sự phát triển của vi khuẩn [69].
+ Các hợp chất khoáng.
Khoáng chất (Mg, Mn và Fe) được cung cấp trong môi trường nuôi cấy và lên men ở dạng muối (MgSO4, MnSO4 và FeSO4).
Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển của các vi khuẩn lactic cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: Photpho, lưu huỳnh, kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri… đặc biệt là mangan. Mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn. Chính vì vậy mà trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic, người ta thường bổ sung muối MnSO4. Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Mg2+, Fe2+
có tác dụng tích cực lên sự phát triển và sản sinh ra axit lactic.