CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử
2.2.1.5. Kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2
- Chuẩn bị mẫu: Từ 2 ống giống bảo quản chủng Y6 và HC2 lấy ra 100àl dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 900àl dung dịch nước muối sinh lớ đó vụ trựng ở nhiệt độ phũng, trộn kĩ bằng thiết bị vortex thu được dịch pha loãng mẫu có nồng độ là 10-1. Quá trình này lặp lại liên tục để có dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-10. Dùng pipet với đầu côn vô trựng, hỳt 100àl dịch pha loóng trờn cấy trang trờn mụi trường YE - xylose (cellobiose) agar. Nuôi ở 37oC trong 2 ngày để thu được các khuẩn lạc của chủng Y6 và HC2.
- Thí nghiệm: Dùng que cấy đã vô trùng chấm trên khuẩn lạc của chủng Y6 và ria que cấy trên đĩa chứa môi trường kiểm tra khả năng đối kháng của 2 chủng vi khuẩn (YE - cellobiose, xylose agar). Sau đó hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, chờ nguội que cấy tiếp tục chấm que trên khuẩn lạc của chủng HC2 và tiến hành ria que cấy trên đĩa thạch đã chứa đường ria của chủng Y6 với điều kiện 2 đường ria phải giao nhau (theo kiểu ria chéo).
Đem đĩa thạch đã được cấy nuôi ở 37oC trong 2 ngày để kiểm tra tính đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Y6 và HC2.
2.2.2. Phương pháp ên men.
Lên men axit lactic từ đường xylose, cellobiose và dịch thủy phân rơm rạ được tiến hành như sau :
- Lên men axit lactic từ đường xylose và cellobiose: Quá trình lên men axit lactic được tiến hành theo phương pháp lên men gián đoạn. Bình thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường YE - xylose hoặc YE - cellobiose, tỉ lệ cấp giống, nồng độ đường, nhiệt độ, pH ban đầu, tốc độ lắc là các yếu tố được thay đổi theo từng thí nghiệm khảo sát,
43
lên men thực hiện trong 120 giờ. Sau đó, thu dịch và đem xác định lượng axit tổng tạo thành và phân tích lượng axit lactic tạo thành bằng phương pháp HPLC.
- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ qui mô 200ml: Bình thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường YE sử dụng đường từ dịch thủy phân rơm rạ (cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l và xylose 8,16 g/l), điều kiện: Duy trì pH 6,2 bằng NaOH 2N, lượng giống cấp 10% theo thể tích trong đó tỉ lệ L. plantarum HC2 : L.
fermentum Y6, nhiệt độ, tốc độ lắc, nồng độ đường và nồng độ cao nấm men thay đổi theo từng thí nghiệm khảo sát.
- Lên men axit lactic qui mô 2 lít. Thiết bị lên men 2 lít chứa 1500 ml môi trường YE - dịch thủy phân rơm rạ trong đó hàm lượng đường (cellobiose 11,3 g/l; glucose 16,9 g/l và xylose 8,16 g/l), hàm lượng cao nấm men 3 g/l, pH 6,2 được duy trì bằng NaOH 2N, tỉ lệ giống cấp 10% theo thể tích trong đó tỉ lệ L. plantarum HC2 : L. fermentum Y6 bằng 2 :1; nhiệt độ 37oC. Lên men diễn ra trong 48 giờ, canh trường thu được sẽ xác định lượng axit lactic tạo thành và lượng đường dư.
- Xác định hiệu suất lên men axit lactic [142].
Hiệu suất lên men = (A/D) × 100
Trong đó: A: Lượng axit lactic thu được sau quá trình lên men (g/l).
D: Lượng đường tiêu thụ trong quá trình lên men (g/l).
2.2.3. Phương pháp hóa í - sinh.
2.2.3. . Định lượng đường khử bằng DNS.
Đường khử được xác định theo phương pháp của Miller G.L. [72]. Bổ sung 1 ml thuốc thử DNS vào 0,2 ml mẫu thí nghiệm, đun sôi trong 10 phút, làm lạnh nhanh, đo độ hấp thụ ở bước sóng 540 nm, dựa vào đồ thị đường chuẩn glucose suy ra hàm lượng đường khử có trong mẫu.
2.2.3.2. Xác định hàm lượng axit tổng theo Therner.
Chuẩn độ lượng axit bằng NaOH 0,05N với chất chỉ thị là phenolphthalein. Chuẩn độ axit được tính như axit lactic (w/v). Mỗi ml của NaOH 1N tương đương với 90,08 mg axit lactic dựa vào đó để tính ra lượng axit tạo thành [125].
2.2.3.3. Xác định hàm lượng axit lactic, hàm lượng đường theo phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC).
a. Xác định hàm lượng axit, đường trong dịch lên men.
Xử lý mẫu: Đem dịch nuôi cấy ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút, sau đú thu dịch nổi, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,2àm.
44
Pha dung dịch axit lactic, axit axetic, axit propionic chuẩn với các nồng độ 0,5 g/l;
1 g/l; 1,5 g/l .
Pha dung dịch đường chuẩn có nồng độ từ 0,05g/l - 1,5 g/l.
Chạy sắc kí với mẫu đã được xử lý.
Hàm lượng axit và đường trong dịch lên men được xác định bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Agilent 1200, USA) trên cột AminexHPX-87H với dertector RI, sử dụng H2SO4 ở pha động với tốc độ dòng 0,6 ml/phút, nhiệt độ của cột và detector duy trì ở 55oC và 45oC [19].
b. Phân tích thành phần dung dịch đường trong dịch thủy phân rơm rạ.
Xử lý mẫu: Mẫu phân tích ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó thu dịch nổi, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,2àm.
Pha các dung dịch đường chuẩn có nồng độ từ 0,05g/l - 1,5 g/l.
Chạy sắc kí với mẫu được xử lý: Hàm lượng đường được xác định bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Agilent 1200, USA) trên cột AminexHPX-87H. Pha tĩnh có kích thước hạt 9 àm, dải pH hoạt động 5 - 9. Pha động là nước khử ion được lọc qua màng 0,45 àm và khử khí. Chế độ phân tích được giữ ở nhiệt độ 60oC với tốc độ dòng 0,4 ml/phút, nhiệt độ của dertector RI 35oC.
Số liệu được xử lý bằng phần mềm: Agilent 2DLC Chemstation Software.
2.2.3.4. Phương pháp tiền xử lý rơm rạ bằng kiềm (NaOH) theo phương pháp nấu kín . Rơm rạ được nghiền bằng máy nghiền với kích thước lỗ sàng 0,7cm, sàng lọc loại bỏ phần vụn ở dưới sàng thu phần trên sàng, làm đồng đều mẫu, để bão hòa ẩm sau đó bảo quản trong các túi nilông kín ở điều kiện phòng thí nghiệm và sử dụng cho nghiên cứu.
Quá trình tiền xử lý rơm rạ được tiến hành trong nồi inox có dung tích 1 lít, gia nhiệt trong bể glyxerin. Mỗi mẻ tiến hành 35g nguyên liệu khô tuyệt đối, thành phần dịch nấu NaOH 0,1N ở mức dùng 5% so với rơm rạ, nhiệt độ xử lý 100oC trong 120 phút. Rơm rạ sau xử lý được đánh tơi, rửa bằng axit axetic, xử lý bằng đệm natri citrate 0,05M sau đó tiếp tục được thủy phân bằng enzyme [79].
2.2.3.5. Phương pháp thủy phân rơm rạ bằng hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic® Htec2 .
Thủy phân rơm rạ sau tiền xử lý kiềm theo phương pháp nấu kín bằng hỗn hợp enzyme thương phẩm Cellic® Ctec2 và Cellic® Htec2 với tỉ lệ 4:1 về thể tích, nhiệt độ 50oC, được tiến hành trong các bình thủy tinh có nắp dung tích 500 ml, các bình đã được khử trùng ở 121oC trong 20 phút. Dung dịch đệm citrat 0,05M, pH5 được sử dụng làm môi
45
trường thủy phân. Mức sử dụng hỗn hợp enzyme 15,6U/g rơm rạ sau tiền xử lý trong đó:
Hàm lượng rơm rạ sau tiền xử lý là 10,77%; thời gian thủy phân 94,25 giờ [79].
Hình 2.1. Sơ đồ qui trình tiền xử lý và thủy phân rơm rạ
2.2.3.6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men axit lactic của chủng vi khuẩn được lựa chọn.
Trong quá trình khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, sẽ cho một yếu tố thay đổi và các yếu tố khác cố định; điều kiện được chọn của yếu tố khảo sát trước được sử dụng cho yếu tố tiếp theo.
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ.
Đối với quá trình lên men axit lactic của chủng L. fermentum Y6 từ xylose: Điều kiện nuôi pH ban đầu bằng 5,5; nồng độ đường xylose 10g/l; tỉ lệ cấp giống 10%, nuôi tĩnh. Nhiệt
Rơm rạ
Nghiền lỗ sàng có kích thước 0,7cm
Thủy phân
Rơm rạ sau tiền xử lý 10,77%; thời gian thủy phân 94,25 giờ,mức sử dụng hỗn hợp
enzyme 15,6U/g, nhiệt độ 50oC Tiền xử lý
Rơm rạ 35g, NaOH 5% so với rơm rạ khô ở 100oC, thời gian 120 giờ
Rửa, lọc, đánh tơi
Dịch thủy phân
46
độ được khảo sát ở các mức 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 45oC. Sau 24 giờ lấy mẫu và xác định lượng axit tạo thành và pH.
Lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2 từ cellobiose: Điều kiện nuôi cấy:
pH ban đầu bằng 5,5; nồng độ đường cellobiose 10g/l; tỉ lệ cấp giống 10%, nuôi tĩnh. Thí nghiệm được tiến hành trong môi trường YE lỏng ở các mức nhiệt độ 25oC, 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 45oC. Sau 24 giờ lấy mẫu và xác định lượng axit tạo thành và pH.
Quá trình lên men axit lactic của hỗn hợp chủng L. fermentum Y6 và L. plantarum HC2 từ dịch thủy phân rơm rạ: Điều kiện nuôi cấy như: pH ban đầu 6,2 được duy trì bằng NaOH 2N; nồng độ đường dịch thủy phân 38 g/l; tỉ lệ cấp giống 10% (HC2 : Y6 = 1:1) nuôi lắc 100 vòng/phút. Nhiệt độ khảo sát ở các mức 33oC; 35oC; 37oC và 39oC. Lấy mẫu ở các mốc thời gian 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ để xác định lượng axit tạo thành, lượng đường khử dư và đo OD600nm.
b. Ảnh hưởng của pH ban đầu.
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình sản xuất axit lactic bởi chủng L. fermentum Y6 từ xylose được tiến hành ở các giá trị pH ban đầu: 4; 4,5; 5; 5,5; 6;
6,5; 7 và 7,5. Sau 24 giờ lấy mẫu và xác định lượng axit tạo thành và pH.
Đối với quá trình lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2 từ cellobiose: Thí nghiệm được tiến hành ở các giá trị pH ban đầu: 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7 và 7,5. Sau 24 giờ lấy mẫu và xác định lượng axit tạo thành và pH.
c. Ảnh hưởng của nồng độ đường.
Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường đến quá trình lên men axit lactic của chủng L. fermentum Y6 từ xylose ở các nồng độ đường xylose: 5; 10; 15; 20 và 25 (g/l). Sau mỗi 24 giờ lấy mẫu đem định lượng axit và pH.
Đối với quá trình lên men axit lactic của chủng L. plantarum HC2 từ cellobiose: Thí nghiệm được tiến hành ở các nồng độ đường cellobiose: 5; 10; 15; 20 và 25 (g/l). Sau mỗi 24 giờ lấy mẫu đem định lượng axit và pH.
Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L. fermentum Y6 và L. plantarum HC2 , nồng độ đường thay đổi trong khoảng 10 g/l; 20 g/l; 30 g/l; 38 g/l và 76 g/l. Dịch thủy phân rơm rạ được pha loãng theo tỉ lệ 1: 8; 1:4; 1: 2 để đạt được nồng độ đường lần lượt là 10 g/l; 20 g/l và 38 g/l. Ngoài ra, khi trộn tỉ lệ 1:8 và 1: 4 ta sẽ tương ứng được nồng độ đường 30 g/l. Lấy mẫu ở các mốc thời gian 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ để xác định lượng axit tạo thành, lượng đường khử dư và đo OD600nm.
d. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống.
47
Hai chủng vi khuẩn L. fermentum Y6 và L. plantarum HC2 được tăng sinh trong môi trường LB đến khi đạt mật độ tế bào 109 CFU/ml, canh trường này được sử dụng như nguồn cấp giống ở các thí nghiệm khảo sát.
Lên men sản xuất axit từ đường xylose và cellobiose sẽ khảo sát ở các giá trị 5%;
10%; 15%; 20% và 25% theo thể tích. Sau mỗi 24 giờ lấy mẫu đem định lượng axit.
Lên men sản xuất axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ chọn tỉ lệ cấp giống 10%
theo thể tích và khảo sát tỉ lệ giống HC2 : Y6 ở các tỉ lệ 1:1; 2:1; 3:1 và 4:1. Lấy mẫu ở các mốc thời gian 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ để xác định lượng axit tạo thành, lượng đường khử dư và đo OD600nm.
e. Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men.
Đối với quá trình lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men ở các nồng độ 1 g/l; 3 g/l; 5 g/l; 7 g/l và 9 g/l. Lấy mẫu ở các mốc thời gian 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ để xác định lượng axit tạo thành, lượng đường khử dư và đo OD600nm.
e. Ảnh hưởng của tốc độ lắc.
Sau khi đã chọn được các yếu tố nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường, tỉ lệ cấp giống. Tiến hành khảo sát tốc độ lắc ở các tốc độ: 0 vòng/phút; 50 vòng/phút; 100 vòng/phút và 150 vòng/phút. Tiến hành lấy mẫu sau 24h đối với sinh tổng hợp axit từ xylose và cellobiose.
Lên men axit lactic từ dịch thủy phân rơm rạ bởi hỗn hợp chủng L. fermentum Y6 và L. plantarum HC2 sẽ được tiến hành trong các điều kiện pH 6,2 duy trì bằng NaOH 2N, nhiệt độ, hàm lượng cao nấm men, hàm lượng đường, tỉ lệ cấp giống như đã chọn ở kết quả thí nghiệm trên, xét tốc độ lắc ở các giá trị: 0 vòng/phút, 50 vòng/phút; 100 vòng/phút, 150 vòng/phút và 200 vòng/phút. Lấy mẫu ở các mốc thời gian 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ để xác định lượng axit tạo thành, lượng đường khử dư và đo OD600nm.
2.2.3.7. Ảnh hưởng của duy trì pH trong quá trình lên men.
pH ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình lên men axit lactic. Do đó, sau khi chọn được pH ban đầu thích hợp cho quá trình lên men axit lactic từ xylose và cellobiose. Tiến hành lên men với các điều kiện đã tối ưu được về nhiệt độ, pH ban đầu, nồng độ đường, tỉ lệ cấp giống trong đó duy trì pH ban đầu bằng NaOH 2N trong suốt quá trình lên men. Sau 48 giờ xác định lượng axit tạo thành bằng phương pháp xác định hàm lượng axit tổng số và lượng đường dư bằng phương pháp định lượng đường khử bằng DNS. Định lượng axit lactic tạo thành và đường dư bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC.
48
2.2.3.8. Xác định dạng D, L axit lactic trong dịch lên men từ dịch thủy phân rơm rạ.
a. Thu hồi và tinh sạch axit lactic.
Thu hồi và tinh sạch axit lactic là một giai đoạn quan trọng để thu được axit lactic có độ tinh khiết nhất định. Nghiên cứu thu hồi axit lactic từ dịch lên men theo phương pháp truyền thống bằng cách cho tạo kết tủa với ion Ca2+ [4] (hình 2.2).
- Hàm lượng than hoạt tính: 1,5%
- pH của dịch thu hồi: 10-11 - Nhiệt độ kết tinh: 5oC - Thời gian kết tinh: 24 giờ Thu hồi axit lactic từ canxi lactat:
- Hàm lượng than hoạt tính: 0,5%
- Phương pháp sử dụng: phương pháp trao đổi ion
Hình 2.2. Sơ đồ qui trình thu hồi axit lactic Li tâm thu lactatcanxi H2SO4 60%
Cô đặc dịch canxilactat
Kết tinh
Gia nhiệt ở 85oC trong 10 phút
Lọc
Xử lý bằng than hoạt tính
Điều chỉnh pH = 10 -11 Dịch lên men
Axit lactic
49 b. Định dạng D, L axit lactic.
Phương pháp hiệu quả để xác định dạng D, L axit lactic đó là đo góc quay cực của hỗn hợp đồng phân đó. Các mẫu được đo bằng máy quang phổ kế phân cực Jasco - j - 710 - spectropolarimeter, cách đo theo TCVN 8446 - 2010 như sau:
- Giá trị góc quay cực của một chất ứng với một độ dài bước sóng xác định và nhiệt độ không đổi ứng với chiều dày ống đo bằng 10mm và nồng độ chất phân tích bằng 1 g/ml sẽ có một trị số nhất định được gọi là góc quay cực riêng.
[α]λt
= t: nhiệt độ đo mẫu (21-22 °C)
λ: Bước sóng của tia sáng phân cực, thông thường sử dụng bước sóng vàng của natri ở 589.3nm
L: là chiều dài cuvet (mm), sử dụng ống chuẩn 10mm A: góc quan sát được (oC)
- Độ quay cực của một hỗn hợp đồng phân quang học được xác định theo góc quay riêng của mỗi loại cần đo theo công thức:
α = [α]λt
/c c: nồng độ dung dịch đo (g/ml)
- Góc quay riêng của hỗn hợp đồng phân quang học được tính [α]= x1 × [α]1 + x2 × [α]2
x1, x2 là phần trăm các đồng phân có trong hỗn hợp
[α]1,[α]2 là 2 chất đối quang, có giá trị quay cực bằng nhau nhưng ngược dấu nhau:
L- axit lactic làm quay mặt phẳng phân cực về phía phải với độ quay cực riêng +2.67o trong khi D - axit lactic làm quay mặt phẳng phân cực về phía trái với độ quay cực riêng - 2.67o.
Xác định tỉ lệ đồng phân axit lactic với cuvet có chiều dài 10mm, bước sóng đèn hơi natri là 589nm, nhiệt độ phòng 20oC với các nồng độ khảo sát 0,1; 0,2 và 0,3 g/ml.
2.2.4. Phương pháp toán học.
2.2.4.1. Tối ưu hóa quá trình lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum Y6 và từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2.
Sử dụng phần mềm Design Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis, Mỹ) để phân tích các hệ số hồi quy, thiết lập bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa theo hàm mong đợi.
ANOVA được sử dụng để đánh giá các thông số thống kê.
50
- Bước 1. Xây dựng mô hình toán học dạng y = b0 + b1X1 + b11 X1
2+ b2 X2 + b22
X22 + b3X3+ b33X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
+ Xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi của từng biến từ khảo sát thực nghiệm như trên bảng 2.3 và 2.4.
Bảng 2.3. Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ xylose của chủng L. fermentum Y6
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
X1 Nhiệt độ oC 30 44
X2 pH 4,5 7,5
X3 Nồng độ đường g/l 5 15
Bảng 2.4. Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu lên men axit lactic từ cellobiose của chủng L. plantarum HC2
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
X1 Nhiệt độ oC 30 44
X2 pH 4,5 7,5
X3 Nồng độ đường g/l 5 15
+ Lập ma trận thực nghiệm theo Box-Benken: gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình), trong đó có 5 thí nghiệm lặp ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 2.5 và bảng 2.6 ).
Quá trình lên men axit lactic được tiến hành theo phương pháp lên men gián đoạn . Bình thủy tinh 200 ml nút cao su chứa 150ml môi trường, cấp giống với tỉ lệ 10% trong 120 giờ. Sau đó, thu dịch và đem xác định lượng axit tổng tạo thành.
+ Tính toán hệ số của hàm hồi quy
+ Kiểm tra độ phù hợp của mô hình và sự có nghĩa của các hệ số hồi quy + Đánh giá sự sai lệch giữa mô hình và thực nghiệm theo chuẩn Fisher
- Bước 2. Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kỳ vọng
51
Tìm cực trị của phương trình hồi quy y = b0 + b1X1 + b11 X1
2+ b2 X2 + b22 X2 2 + b3X3+ b33X32
+ b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert 7.15 cho các kết quả đạt giá trị cực trị tại X1, X2, X3 tương ứng với nhiệt độ, pH và nồng độ đường
Bảng 2.5. Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ xylose
TN Nhiệt độ
(độ C) pH Nồng độ
đường (g/l) TN Nhiệt độ
(độ C) pH Nồng độ đường (g/l)
1 30 4,5 10 9 37 4,5 5
2 44 4,5 10 10 37 7,5 5
3 30 7,5 10 11 37 4,5 15
4 44 7,5 10 12 37 7,5 15
5 30 6,0 5 13 37 6,0 10
6 44 6,0 5 14 37 6,0 10
7 30 6,0 15 15 37 6,0 10
8 44 6,0 15 16 37 6,0 10
17 37 6,0 10
Bảng 2.6. Ma trận thực nghiệm tối ưu hóa lên men axit lactic từ cellobiose
TN Nhiệt độ
(độ C) pH Nồng độ
đường (g/l) TN Nhiệt độ
(độ C) pH Nồng độ
đường (g/l)
1 30 4,5 10 9 37 4,5 5
2 44 4,5 10 10 37 7,5 5
3 30 7,5 10 11 37 4,5 15
4 44 7,5 10 12 37 7,5 15
5 30 6,0 5 13 37 6,0 10
6 44 6,0 5 14 37 6,0 10
7 30 6,0 15 15 37 6,0 10
8 44 6,0 15` 16 37 6,0 10
17 37 6,0 10
Tiến hành thực nghiệm
Lên men axit lactic từ đường xylose với các điều kiện: Nhiệt độ 38oC; nồng độ đường 12 g/l; tỉ lệ cấp giống 10%; pH 6,2 được duy trì bằng NaOH 2N; lắc 50 vòng/phút.