3.1. Lên men axit lactic từ xylose
3.1.1.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose
a. Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann.
Nhằm xác định sản phẩm của quá trình lên men có axit lactic, tiến hành sử dụng thuốc thử Uffelmann. Khi có mặt của axit lactic thì thuốc thử Uffelmann chuyển từ màu tím đen sang màu vàng rơm. Màu vàng rơm càng rõ nếu lượng axit càng nhiều [65].
55
Hình 3.1. Định tính axit lactic bằng thuốc thử Uffelmann của các chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose
Kết quả thu được từ hình 3.1 cho thấy sự thay đổi màu của các dịch khi kết hợp với thuốc thử Uffelmann và trong dịch lên men của 9 chủng đã chọn đều có axit lactic. Như vậy, cả 9 chủng được lựa chọn ở trên đều có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose.
b. Tuyển chọn bằng phương pháp cấy chấm điểm, đục lỗ thạch và định lượng axit bằng NaOH 0,05N.
Các chủng được nuôi cấy trên môi trường YE - xylose ở 37oC trong 96 giờ và canh trường được ly tâm 10.000 vòng/phút trong thời gian 15 phút, sau đó thu dịch trong để thực hiện các phương pháp tuyển chọn nhằm chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp axit cao nhất. Kết quả cho thấy rằng chủng Y5, Y6 cho khả năng lên men cao nhất với tỉ lệ D1/d1 tương ứng là 4,3 và 4,5 (hình 3.2) và D2 - d2 là 5,5 và 6,5 (d2 đường kính lỗ đục (mm), D2 đường kính vòng phân giải) ( hình 3.3).
Hình 3.2. Hình ảnh cấy chấm điểm của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose
56
Hình 3. 3. Hình ảnh đục lỗ thạch của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose
Các canh trường của 9 chủng Y1, Y5, Y6, Y7, MC2, MC5, DC3, HX3, HX10 sau 96 giờ nuôi được lấy mẫu đem ly tâm và chuẩn độ bằng NaOH 0,05N với chất chỉ thị phenolphtalein. Kết quả thể hiện ở hình 3.4 cho thấy chủng Y5 và Y6 sinh lượng axit tương ứng là 5,78 g/l và 6 g/l, còn chủng Y7 thấp nhất (4,74 g/l).
Hình 3.4. àm lượng axit tạo thành của 9 chủng vi khuẩn có khả năng lên men axit lactic từ xylose
Bảng 3.2 thể hiện kết quả tuyển chọn của 9 chủng vi khuẩn theo 3 phương pháp, cho thấy thấy hai chủng Y5 và Y6 có tỷ lệ D2 - d2 và D1/d1 ở phương pháp đục lỗ thạch cũng như cấy chấm điểm và hàm lượng axit thu được cao nhất và gần bằng nhau. Vì vậy, tiến hành xác định khả năng sinh axit lactic của hai chủng Y5, Y6 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC (hình 3.5 và 3.6).
5.21
5.78 6
4.74
5.6 5.2 5.6
5.3 4.8
0 2 4 6 8
Y1 Y5 Y6 Y7 MC2 MC5 HX10 HX3 DC3
Hàm lượng axit (g/l)
Chủng vi khuẩn
57
Bảng 3.2. Đặc điểm các chủng vi khuẩn lên men axit lactic từ đường xylose bằng phương pháp đục lỗ thạch, cấy chấm điểm và định lượng axit
STT Kí
hiệu Đặc điểm hình thái khuẩn lạc D1/d1 D2 – d2
Lượng axit thu được sau 96 giờ (g/l)
1 Y1
Khuẩn lạc tròn, kích thước từ 1,0- 1,4 mm, bề mặt trơn, nhẵn bong, hơi nhầy, trắng trong, không tâm
4,0 5,0 5,21
2 Y5
Khuẩn ạc tròn có kích thước từ 0,6 – 0,8 mm, ề mặt trơn, nhẵn óng, không mép, màu trắng đục
4,3 5,5 5,78
3 Y6
Khuẩn ạc tròn, kích thước từ 0,8-1,1 mm, không mép, ề mặt trơn, nhẵn óng, màu trắng đục
4,5 6,5 6
4 Y7 Khuẩn lạc to tròn kích thước từ 1,5
– 1,8 mm, trắng đục, nhày 3,0 4,0 4,74 5 MC2 Khuẩn lạc to, viền răng cưa, trắng
đục 4,0 3,8 5,6
6 MC5 Trắng ngả vàng, tròn, trơn, nhẵn 4,2 4,8 5,2
7 HX3 Tròn đều, trắng đục, nhẵn 4,5 5,6 5,3
8 HX10 Trắng đục, khuẩn lạc to, tròn đều 4,1 5,0 5,6 9 DC3 Tròn, có tâm, màu trắng sáng, bóng 3,0 4,1 4,8
58
Hình 3.5. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y5
Hình 3.6. Sắc kí đồ HPLC của dịch lên men axit lactic từ xylose của chủng Y6 Bảng 3.3. Hàm lượng axit lactic tạo thành của 2 chủng bằng phương pháp HPLC
Chủng
Axit lactic (g/l)
Axit axetic
(g/l)
Axit propionic
(g/l)
Ethanol (g/l)
Đường xylose dư (g/l)
Hiệu suất lên men lactic
Y5 2,94 1,93 0 _ 4,62 54%
Y6 3,6 2,42 0,2 _ 3,52 56%
Kết quả ở hình 3.5; 3.6 và bảng 3.3 cho thấy, cả hai chủng Y5 và Y6 đều là chủng vi khuẩn lên men dị hình, sản phẩm tạo ra ngoài axit lactic còn axit acetic và axit
59
propionic. Tuy nhiên, hiệu suất lên men axit lactic của chủng Y5 (54%) thấp hơn chủng Y6 (56%). Vì vậy, chủng Y6 được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. Tyree R.W.
và cộng sự đã phân lập được loài L. xylosus có khả năng lên men sản xuất axit lactic từ xylose đạt hiệu suất lên men axit lactic là 48% [122], L. pentosus có khả năng lên men axit lactic từ đường xylose đạt hiệu suất lên men là 56% [117]. Chủng Lc. lactic IO -1 có khả năng chuyển đổi xylose thành axit lactic đạt hiệu suất lên men 46,9% [49] và chủng Lc.
lactic IO-1 JCM 7638 có hiệu suất lên men axit lactic đạt 68% [112].